Quel est l’état d’association d’une protéine membranaire solubilisée : un protocole pour répondre à une question difficile.
CEA
On sait maintenant que certaines activités enzymatiques varient en fonction de l'état d'association des protéines membranaires. Déterminer la quantité de détergents liés et éventuellement de lipides résiduels sur une protéine membranaire solubilisée est alors important car cette donnée est nécessaire pour caractériser son état d'association par ultracentrifugation analytique. Cette détermination permet également de donner une indication sur la surface hydrophobe couverte par la monocouche de détergent qui entoure la protéine.
Ces mesures sont difficiles, car la plupart des détergents utilisés n'ont pas d'absorbance. Un premier protocole utilise des détergents radio-marqués qui sont le fruit d’une collaboration de longue date entre biochimistes et chimistes de l'Ibitec-S. Un deuxième protocole utilise l’augmentation de l’indice de réfraction due à la présence de détergent lié à la protéine. Nous avons aussi combiné deux approches : la filtration sur gel donnant accès à la quantité de détergent lié et au rayon de Stokes et la vitesse de sédimentation par centrifugation analytique donnant accès au coefficient de sédimentation. A partir de ces données (rayon de Stokes et coefficient de sédimentation) la masse moléculaire ainsi que l’asymétrie de la protéine solubilisée peuvent être calculées. Cet article implique donc non seulement deux services de l'IbiTec-s (SB²SM et SCBM) mais aussi deux Instituts du CEA le deuxième étant l'IBS à Grenoble.
le Maire, M, Arnou, B, Olesen C, Georgin, D., Ebel C. and Møller, J.V. (2008). Gel chromatography and analytical ultracentrifugation to determine the extent of detergent binding and aggregation, and Stokes radius of membrane proteins using sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase as an example. Nature Protocols, 3, 1782-1795