Notre projet scientifique vise à déterminer :
• l'architecture des jonctions intercellulaires endothéliales, en recherchant les liens moléculaires de la VE-cadhérine avec le cytosquelette d'actine et en mesurant les forces générées
• les modifications structurales que subit la VE-cadhérine en lien avec la signalisation cellulaire, en cancérologie et dans plusieurs pathologies vasculaires.
Équipe JEA
Jonctions endothéliales et Angiogenèse
 Responsable |
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| Composition de l'équipe |
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| Laurence Bouillet, PH CHU Marie Courçon, technicienne CEA Julie Creuzet, doctorante Laurie Godart, technicienne BTS en alternance Abbas Mgharbel, post-doctorant Michel Moussus, doctorant Helena Polena, post-doctorante Jérémy Razanajatovo, doctorant Adama Sidibe, doctorant Isabelle Vilgrain, DR2 CNRS |
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| Présentation |
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| Architecture des jonctions endothéliales entre cellules |
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Comprendre les interactions cellule-cellule est un enjeu majeur pour expliquer les nombreuses transformations que subit un tissu. Par exemple, dans l'endothélium, le tissu qui tapisse la paroi interne du tronc vasculaire, les jonctions vasculaires endothéliales sont remodelées au cours de la transmigration des cellules inflammatoires ou métastatiques, dans l'angiogenèse ou la vasculogenèse et lors de la réparation de l'endothélium. Dans ce projet, nous pensons que le remodelage de la jonction endothéliale est lié à la dynamique de l'adhérence intercellulaire régie par la VE-cadhérine et par ses connexions au cytosquelette d'actine. En effet, les connexions de la VE-cadhérine au cytosquelette d'actine sont à la base de la création de forces intracellulaires requises pour le remodelage et la réparation de l'endothélium.
Dans le contrat quadriennal précédent, nous avons montré que, dans les jonctions inter-endothéliales matures, l'annexine 2 (A2) connecte le complexe VE-cadhérine-caténines au cytosquelette d'actine [Heyraud et al., 2008]. Nous avons également trouvé que la VE-cadhérine peut être localisée le long ou au bout des filopodes émis par des cellules isolées. Nos données indiquent que la VE-cadhérine se déplace le long de filopodes en étant transportée par une protéine moteur, la myosine X. Cette dernière glisse le long des câbles d'actine intrafilopodiaux en tractant la VE-cadhérine [Almagro et al., 2010]. Ce déplacement de la VE-cadhérine le long de filopodes est un événement clé requis pour la formation des contacts précoces intercellulaires, un processus qui est d'une importance capitale dans la réparation de l'endothélium et l'angiogenèse. Dans les cellules épithéliales, l'EPLIN (Epithelial Protein Lost in Neoplasm) est une autre protéine assurant l'association du complexe E-cadhérine/caténines aux filaments d'actine [Abe and Takeichi, 2008]. Par analogie, nous observons que l'EPLIN relie la VE-cadhérine au cytosquelette d'actine via l'α-caténine dans les cellules endothéliales. Au total, au moins trois protéines (A2, MyoX et EPLIN) connectent indépendamment le complexe à base de VE-cadhérine au cytosquelette d'actine. Les jonctions adhérentes (AJ) composées de cadhérine fonctionnent comme des capteurs mécaniques qui transmettent des forces en particulier celles générées par les filaments d'actine [le Duc et al., 2010]. En ce qui concerne les cellules endothéliales, nous avons observé que lorsqu'elles sont isolées, elles ont la capacité de détecter la rigidité du substrat sur lequel elles adhèrent. En particulier, elles migrent d'un environnement mou vers un environnement rigide comme décrit précédemment pour les fibroblastes 3T3 [Lo et al., 2000]. Mais cette sensibilité à la rigidité est perdue dès que les cellules endothéliales établissent des contacts entre elles. |
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  Objectifs du projet |
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• Analyser, du point de vue moléculaire, les connexions multiples qui s'élaborent entre le complexe à base de VE-cadhérine et le cytosquelette d'actine
• Évaluer l'impact de ces connexions sur la mobilité de la VE-cadhérine dans la membrane plasmique • Mesurer les forces d'interaction régies par les cellules endothéliales à l'aide de biopuces à motifs de rigidité • Étudier les mécanismes à la base de la sensibilité des cellules endothéliales à la rigidité du support. • Examiner les signaux intercellulaires existant entre la voie Fzd7 et l'adhérence intercellulaire régie par la VE-cadhérine. |
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| Programmes de recherche |
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Étude des connexions moléculaires entre VE-cadhérine et filaments d'actine établies via l'EPLIN et via la Myosine-X (D Gulino)Mesure de la mobilité de la VE-cadhérine au niveau des jonctions endothéliales par la microscopie de type FRAP (D Gulino)Mesure des forces d'interaction dans les monocouches endothéliales (D Gulino, collaboration avec A. Nicolas, Laboratoire des Technologies de la Microélectronique-LTM, pôle Minatec, Grenoble)Régulation de la sensibilité des cellules endothéliales à la rigidité du support par les contacts intercellulaires (D Gulino, collaboration avec A. Nicolas, Laboratoire des Technologies de la Microélectronique-LTM, pôle Minatec, Grenoble)Mise en évidence des signaux intracellulaires existant entre la voie Fzd7 et l'adhérence intercellulaire régie par la VE-cadhérine (D Gulino, collaboration avec P. Dufourcq, Inserm U 828, Bordeaux) |
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| La VE-cadhérine en physiopathologie vasculaire |
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L'activité biologique adhésive de la VE-cadhérine est régulée par des modifications post-traductionnelles telles que phosphorylation et clivage au cours de processus inflammatoires ou angiogéniques. Ces modifications n'ont pas lieu dans l'endothélium quiescent.
- Phosphorylation : Les mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation sur tyrosine conduisent à des modifications covalentes de protéines et constituent des événements majeurs dans les processus de transformation, prolifération et différenciation cellulaire. Ces réactions sont catalysées par des tyrosine kinases et régulées par des tyrosine phosphatases. La phosphorylation sur thréonine ou sérine est un mécanisme très fréquent dans la cellule, alors que la phosphorylation sur tyrosine ne représente que 1% des phosphorylations totales d'une cellule. Dans les cellules endothéliales, le domaine cytoplasmique de la VE-cadhérine contient des sites potentiels de phosphorylation sur tyrosine, sites qui sont conservés entre l'homme et la souris. Au cours de ces dernières années le laboratoire a pu montrer les points suivants : 1/ La VE-cadhérine est phosphorylée sur tyrosine in vivo an cours de l'angiogenèse physiologique et non dans les tissus quiescents, et dans des cellules en culture soumises à un stimulus inflammatoire : le PAF [Hudry-Clergeon, et al., 2005]. 2/ La VE-cadhérine est associée in vivo avec des partenaires de la signalisation : association permanente avec la tyrosine kinase Src, et association hormono-regulée avec Flk1, le récepteur de VEGF [Lambeng et al., 2005]. 3/ La tyrosine 685 est le principal acide aminé cible de Src dans le domaine cytoplasmique de la VE-cadhérine de cellules endothéliales stimulées par VEGF [Wallez et al., 2007]. Trois autres sites de phosphorylation de la VE-cadhérine ont été mis en évidence in vitro : Y658 et Y731 [Potter et al., 2005] et S665 [Gavard and Gutkind, 2005], avec des impacts distincts sur les signaux intracellulaires : signaux antiprolifératifs, internalisation et dégradation de la VE-cadhérine suite à l'établissement d'interactions avec la protéine kinase Csk, les caténines ou la ß-arrestine. Notre découverte de la phosphorylation sur tyrosine de la VE-cadherine par Src sur le site Y685, en conjonction avec son existence dans l'angiogenèse physiologique, nous a conduit à examiner son implication dans l'angiogenèse tumorale. Nous avons récemment démontré l'existence de cette phosphorylation in vivo dans des tumeurs cérébrales humaines et dans un modèle murin d'hépatocarcinome. Dans la polyarthrite rhumatoïde siège aussi d'une forte angiogenèse dont un acteur majeur est le TNFα, la VE-cadhérine est également modifiée [Sidibé et al., 2012]. Toutes ces données expérimentales suggèrent l'importance majeure de ces processus de phosphorylation pour lesquels il reste à determiner les implications physiopathologiques de ces sites in vivo. - Clivage : Nous avons préalablement montré in vitro que lorsque les cellules endothéliales sont en contact avec des neutrophiles activés, des protéases telles que la cathepsine G et l'élastase sont capables de cibler le domaine extracellulaire de le VE-cadherine et de fragiliser les jonctions endothéliales [Hermant et al., 2003]]. Plus récemment, nous avons détecté la présence d'une forme tronquée de VE-cadhérine, correspondant a son domaine extracellulaire (sVE : PM 90 kDa), dans des sérums de patients porteurs de gliomes. (Patent WO 2008/062314). De plus dans ce type de cancer, le taux de sVE sérique est un marqueur prédictif de réponse thérapeutique. De façon intéressante, nous avons aussi montré que le clivage de la VE-cadhérine était induit par le VEGF dans des cultures de cellules endothéliales et que l'utilisation d'inhibiteurs de tyrosine kinases empêche ce clivage. Au total, la phosphorylation sur tyrosine de la VE-cadhérine, de même que son clivage, confèrent à la protéine des trans-conformations, modulant ainsi son interaction avec son homologue de la cellule voisine ou avec des partenaires intra-cellulaires. Ces données supportent l'idée que la VE-cadhérine pourrait être un marqueur protéique prototype d'un endothélium activé modifié au cours de processus angiogéniques, inflammatoires et de perméabilité accrue. |
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| Objectifs du projet |
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• Étudier l'impact de la phosphorylation du site Y685 de la VE-cadhérine par analyse d'une souris knock'in Y685F VE-cadherine
• Étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le clivage de la VE-cadhérine et examiner un lien possible entre phosphorylation et clivage de la VE-cadhérine • Examiner la VE-cadhérine sérique de sVE en oncologie-biologique et dans les pathologies vasculaires. |
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| Programmes de recherche |
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Phosphorylation de la VE-cadhérine (I Vilgrain) : Identification des kinases et des sites dans l'angiogenèse tumorale et cancers très vascularisés. Une corrélation avec le degré différencié et/ou invasif sera déterminée,Détection et dosage de sVE et validation de sVE en tant que biomarqueur en oncologie biologique et pathologies vasculaires en collaboration avec le CHU Grenoble et les centres de lutte contre le cancer (I Vilgrain, L Bouillet), Mécanismes de clivage de la VE-cadhérine (I Vilgrain) : Identification de protéases activées dans certaines pathologies inflammatoires, régulation par phosphorylation,Mécanismes moléculaires impliqués dans les syndromes vasculaires associés aux maladies dysimmunitaires et cancer (I Vilgrain, L Bouillet) |