Direction des sciences du vivant

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections chroniques chez les patients atteints de mucoviscidose. Dans ce contexte infectieux, un afflux très important de polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) est observé mais ceux-ci semblent incapables d'éliminer les bactéries. Nous avons étudié l'interaction entre une souche de P. aeruginosa d'origine mucoviscidique, la souche CHA, et les PMNs humains à l'aide d'un modèle in vitrod'infection cellulaire.
La souche CHA est capable d'échapper à l'action bactéricide des PMNs et d'induire leur mort rapide comparée à une souche de référence PAO1 qui est rapidement éliminée. La construction d'un mutant déficient dans le système de sécrétion de type III perd sa capacité à induire la mort des PMNs. La sécrétion de type III est un système de virulence permettant à la bactérie de transloquer directement dans le cytosol des cellules cibles des effecteurs cytotoxiques. Chez P. aeruginosa ces effecteurs sont au nombre de quatre : ExoS, T, Y et U. Seule l'exoenzymeU, est connue pour avoir une activité lytique sur les cellules. L'absence du gène exoU du génome de la souche CHA montre que cette cytotoxicité sur les PMNs est dépendante de la sécrétion de type III et ExoU-indépendante.
Par d'autres modèles d'infections cellulaires, nous montrons que cette souche est capable d'induire une cytotoxicité également rapide sur les macrophages et plus lente sur les lymphocytes B et les lignées épithéliales. Des techniques de biologie cellulaire complétées par des observations de microscopie électronique ont permis de démontrer que la mort est oncotique (perte de l'intégrité membranaire) et non apoptotique. Cette oncose est due à la formation de pores membranaires, démontrée par des expériences d'osmoprotection et de marquage cellulaire.
L'analyse d'isolats cliniques mucoviscidiques a montré que 21 % des isolats sont capables d'induire une telle cytotoxicité type III dépendante et ExoU indépendante. Nous avons montré, grâce à l'utilisation de fusion transcriptionnelle, que la plupart des souches non cytotoxiques n'exprimaient pas le système de sécrétion de type III dans des conditions d'induction. Mais l'expression en trans dans ces souches du gène exsA restaure l'expression de la sécrétion de type III et rend les souches cytotoxiques.
Afin de rechercher les gènes nécessaires à l'expression de la cytotoxicité sur les PMNs, une banque de 5000 mutants de transposition de la souche CHA a été réalisée. Le criblage de cette banque pour la perte du phénotype cytotoxique a permis d'isoler 48 mutants non cytotoxiques. Le clonage et le séquençage des gènes mutés nous ont permis d'identifier 38 gènes différents. Ces gènes peuvent être regroupés en trois catégories : ceux impliqués dans l'adhésion aux PMNs, ceux nécessaires au système de sécrétion de type III et les candidats potentiels pour des effecteurs cytotoxiques.