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Formation des centres binucléaires à fer et biosynthèse du coenzyme Q


Formation des centres binucléaires à fer et biosynthèse du coenzyme Q chez l'eucaryote modèle Saccharomyces cerevisiae
Responsable
 
Dr. Fabien Pierrel
Chercheur CNRS
iRTSV/LCBM
CEA Grenoble
17 rue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
Tel. : (33) 4 38 78 91 10
Fax : (33) 4 38 78 91 24
Biosynthèse du coenzyme Q
 
Le coenzyme Q (ubiquinone ou Q) est une molécule organique lipophile composée d'une benzoquinone substituée et d'une chaîne polyprényle contenant 6 unités chez la levure (Q6) et 10 chez l'homme (Q10). Q a un rôle bien connu de transporteur d'électrons dans les chaînes respiratoires et fonctionne également comme un antioxydant membranaire. La déficience primaire en Q10 a maintenant été attribuée à des mutations dans 6 gènes de la biosynthèse de Q10 et cause des pathologies sévères. La biosynthèse de Q est mitochondriale et nécessite au moins 9 protéines chez la levure (Coq1p-9p) (Figure 1). Le 4-hydroxybenzoate (4-HB) est le précurseur bien connu du noyau aromatique de Q. Malgré de nombreuses recherches et l'importance cruciale de Q dans le métabolisme eucaryote, certaines étapes de la voie de biosynthèse de Q ne sont pas connues. Nous utilisons une combinaison de génétique et de biochimie afin de mieux comprendre la biosynthèse de Q.

Nous avons récemment découvert que la ferrédoxine mitochondriale Yah1 et sa réductase associée, Arh1, sont essentielles à la biosynthèse de Q chez la levure et plus particulièrement à l'hydroxylation C5 (Figure 1) (Pierrel et al., 2010). Nous avons également démontré que l'acide para-aminobenzoique (pABA) est un précurseur in vivo de Q chez la levure (Pierrel et al., 2010). Cette découverte implique la conversion d'une amine en hydroxyle lorsque pABA est utilisé comme précurseur de Q et nous essayons de caractériser cette étape par des approches génétiques.



Figure 1 : Voie de biosynthèse du Coenzyme Q chez la levure S. cerevisiae.
Le para-hydroxybenzoate (4-HB) est prenylé par Coq2 puis 3 réactions d'hydroxylations, 3 méthylations et une décarboxylation conduisent à Q. Nous avons découvert que le para-aminobenzoate (pABA, en bleu) est aussi prenylé par Coq2 et convertit en Q. Les enzymes qui convertissent le prenyl-hydroxybenzoate et le prenyl-pABA en Q sont très certainement les mêmes, seule une réaction supplémentaire de déamination-hydroxylation doit se produire dans le cas du prenyl-pABA.

Nos avons pu prouver que la protéine Coq6, proposée comme étant une monooxygénase à flavine, intervient dans une seule des trois réactions d'hydroxylation que compte la voie de biosynthèse de Q : l'hydroxylation C5 (Ozeir et al., 2011). Une déficience dans cette étape d'hydroxylation peut être complémentée chez la levure S. cerevisiae en ajoutant des analogues du 4-HB tel que l'acide vanillique (VA) ou l'acide 3,4-dihydroxybenzoïque qui contiennent un groupement méthoxyl/hydroxyl en position C5 (Figure 2). Ce résultat ouvre de nouvelles perspectives pour traiter les déficiences en coenzyme Q qui jusqu'à présent sont traitées par supplémentation en coenzyme Q. Nous étudions actuellement l'hypothèse selon laquelle Yah1 et Arh1 pourraient, de manière inhabituelle, constituer le système réducteur physiologique de la monooxygénase à flavine Coq6.



Figure 2 : Coq6 est nécessaire à l'hydroxylation C5 de la voie de biosynthèse de Q6 et une déficience à cette étape peut-être complémentée par des analogues du 4-HB.
Les différentes étapes conduisant à la biosynthèse de Q6 dans des souches WT de S. cerevisiae est montrée (au-dessus de la ligne pointillée) avec l'implication de Coq6, Yah1 et Arh1 dans l'hydroxylation C5. Dans des mutants (en-dessous de la ligne pointillée) déficients pour l'hydroxylation C5 (flèche barrée), la décarboxylation C1 (flèche pointillée) et l'hydroxylation C1 conduisent à la formation de 3-hexaprényl-4-hydroxyphénol (4-HP) lorsque le 4-HB est prénylé, ou à la formation de 3-hexaprényl-4-aminophénol (4-AP) lorsque pABA est prénylé (bleu). 3,4-diHB and VA contiennent un groupement C5-hydroxyl (vert) ou C5-méthoxyl (vert) supplémentaire par rapport au 4-HB et permettent de restaurer in vivo la biosynthèse de Q6 après avoir été prénylés par Coq2.
Assemblage des centres binucléaires à fer
 
Le fer et le cuivre sont des métaux rédox essentiels à la cellule. Le transport et la livraison intracellulaire de cuivre aux protéines cibles dépend de métallochaperones bien caractérisées. Le transport et la mobilisation intracellulaire du fer reste obscure. Le fer est notamment présent dans des métalloprotéines sous forme de centres Fe-S, d'hèmes ou de centres binucléaires à fer. La biosynthèse des Fe-S et des hèmes dépend d'une machinerie cellulaire complexe récemment identifiée. Curieusement, aucune information n'est disponible concernant la biosynthèse des centres binucléaires à fer dans la cellule. Les centres binucléaires à fer sont présents dans des enzymes essentielles du métabolisme eucaryote. Chez la levure, la petite sous unité de la ribonucléotide réductase (Rnr2, biosynthèse des désoxyribonucléotides de l'ADN), la C4 méthyle stérol oxydase (Erg25, synthèse de l'ergostérol) et Coq7 (une protéine de la voie de biosynthèse du coenzyme Q) possèdent toutes un centre binucléaire à fer. Nous voulons caractériser le processus d'assemblage des centres binucléaires à fer in vivo dans la levure Saccharomyces cerevisiae en étudiant la métallation in vivo des protéines Rnr2 et Coq7. Une question importante non résolue est de savoir si la biosynthèse des centres binucléaires à fer est un processus spontané ou assisté (existence de métallochaperones comme pour le transport intracellulaire du cuivre).

La deméthoxyubiquinone hydroxylase Coq7 :

L'activité de Coq7 dépend de son centre binucléaire à fer est essentielle à la biosynthèse mitochondrial de Q, la molécule qui assure le transfert d'électrons entre les complexes respiratoires I/II et III. La mesure de l'activité in vivo de Coq7 est réalisée en quantifiant dans des extraits lipidiques de levure le substrat deméthoxyubiquinone (DMQ6) et le produit final, le coenzyme Q6 par détection électrochimique couplée à l'HPLC (Figure 3).



Figure 3 : Quantification du coenzyme Q6 et de DMQ6 par détection électrochimique couplée à l'HPLC
Une extraction organique des cellules en présence de coenzyme Q4 (ajouté comme standard) permet de purifiés les lipides cellulaires qui sont ensuite injectés sur une colonne C18. Les cellules deplétées pour Grx3 and Grx4 montre une diminution de CoQ6 et une accumulation de DMQ6 suggérant une inhibition de Coq7.

En collaboration avec le groupe du Professeur Roland Lill, nous avons récemment démontré que deux glutarédoxines cytosoliques, Grx3 et Grx4, sont importantes pour l'activité in vivo de Coq7. Grx3 et Grx4 lient le fer et d'autres phénotypes de la souche déplétée en Grx3 et Grx4 laissent penser que ces 2 protéines sont indispensables au trafic intracellulaire du fer (Mühlenhoff et al., 2010).

La petite sous-unité de la ribonucléotide réductase (Rnr2) :

L'hydroxyurée (HU) est un inhibiteur de la ribonucléotide réductase qui a été largement utilisé comme anticancéreux. HU détruit le radical tyrosinyl de Rnr2 et dissocie le centre binucléaire à fer. La plupart des gènes permettant l'import et la remobilisation intracellulaire du fer chez la levure sont sous le contrôle des activateurs transcriptionnels Aft1 et Aft2. Une souche ne possédant pas ces activateurs transcriptionnels (Δaft1Δaft2) est sensible à HU (Figure 4). Ce résultat laisse penser que la souche Δaft1Δaft2 n'est pas capable de métaller de façon optimale le centre binucléaire à fer de Rnr2 lors d'un stress HU.



Figure 4 : Dilution en série d'une souche WT, de la souche Δaft1Δaft2 et des mutants de la souche Δaft1Δaft2 isolés après mutagenèse aléatoire. Les cellules ont été déposées sur du milieu YPD-agar contenant ou non 150mM d'hydroxyurée (HU). La souche Δaft1Δaft2 est sensible à l'hydroxyurée alors que les mutants sont résistants.

Nous avons isolé des mutants de la souche Δaft1Δaft2 qui résistent à l'hydroxyurée (Figure 4). Ces mutants montrent également une amélioration d'autres phénotypes fer-dépendants ce qui laisse penser que les mutations n'induisent pas spécifiquement une meilleure métallation de Rnr2 mais améliorent le métabolisme du fer en général. Cette approche génétique pourrait permettre l'identification de nouveaux facteurs de l'homéostasie du fer.
 
Bibliographie
 

Ozeir M, Mühlenhoff U, Webert H, Lill R, Fontecave M and Pierrel F
Coenzyme Q biosynthesis: Coq6 is required for the C5-hydroxylation reaction and substrate analogs rescue Coq6 deficiency.
Chemistry & Biology, 2011, 18(9): 1134–1142

Mühlenhoff U, Molik S, Godoy JR, Uzarska MA, Richter N, Seubert A, Zhang Y, Stubbe J, Pierrel F, Herrero E, Lillig CH and Lill R
Cytosolic monothiol glutaredoxins function in intracellular iron sensing and trafficking via their bound iron-sulfur cluster.
Cell Metabolism, 2010, 12(4): 373-385

Pierrel F, Hamelin O, Douki T, Kieffer-Jaquinod S, Mühlenhoff U, Ozeir M, Lill R and Fontecave M
Involvement of mitochondrial ferredoxin and para-aminobenzoic acid in yeast coenzyme Q biosynthesis.
Chemistry & Biology, 2010, 17(5): 449-459 - pdf