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Instituts/ Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant (iRTSV)/ Unités / Chimie et Biologie des Métaux (CBM)/ Thèses soutenues/ 2005/ 2005/ Christelle Mathé

Christelle Mathé

Christelle Mathé

Résumé

Études structure-fonction des superoxide réducatses. Mise en évidence de nouvelles espèces intermédiaires au niveau du site actif.

Les superoxyde réductases (SOR) représentent une nouvelle classe d'enzyme, par laquelle des organismes microaérophyles ou anaérobes éliminent le superoxide O2.- . Elles catalysent la réduction mono-électronique de OO2.- pour former exclusivement H2O2 :

O2.- + 1 e- + 2H+ --> H2O2

Le site actif des SOR est formé d'un centre mononucléaire à fer atypique dans lequel le Fe2+ est lié à 4 histidines équatoriales et 1 cystéine axiale dans une géométrie pyramidale à base carrée. Sous sa forme oxydée, la sixième position de coordination du métal est occupée par le carboxylate d'un résidu de glutamate conservé. Les SOR sont divisées en trois classes, qui se différencient principalement par la présence ou non d'un domaine N-terminal renfermant un site métallique de type rubrédoxine.
L'étude par spectroscopie Raman de résonance d'une SOR de chacune des trois classes nous a permis de mettre en évidence des variations structurales au niveau du site actif entre ces classes. On a observé un renforcement du pouvoir électrodonneur du soufre du ligand cystéine vis-à-vis du fer de classe 1 à la classe 3. Des études sur des mutants de l'environnement de cette cystéine ont permis de vérifier que la conformation de celle-ci est directement influencée par ces proches voisins.
Des espèces de type Fe3+-OOH ont été proposées comme intermédiaires réactionnels possibles du cycle catalytique des SOR. Durant cette étude, nous avons démontré que les SOR sont capables de former de façon transitoire une espèce de type Fe3+-η2-peroxo nonprotonée au niveau du site actif après réaction avec un excès de H2O2. La mutation du glutamate conservé en alanine permet la stabilisation de l'espère Fe3+-η2-peroxo indiquant que le glutammate facilite la libération du H2O2. Ce résidu pourrait également représenter une protection vis-à-vis d'altérations oxydatives de l'enzyme.
Nous avons identifié une espèce Fe3+-hydroxyde formée à haut pH au niveau du site actif. Elle est responsable des changements spectroscopiques UV-visible dépendants du pH. Des expéreinces d'échange isotopique 18O/16O ont montré que cette espèce HO- vient du solvant, par déprotonation d'une molécule d'eau. Cette molécule d'eau pourrait être la source d'un des deux protons impliqués dans la formation de H2O2 après réduction du superoxyde.
Enfin, nous avons montré que la lysine contigüe au glutamate conservé est en interaction avec les espèces Fe3+-hydroxyde et Fe3+-η2-peroxo. Elle affaiblie leur fixation sur le fer et favoriserait ainsi le départ de H2O2 durant la catalyse.

Soutenue le 27 janvier 2005 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Paris V - René Descartes

Jury :


Président : Dr. Jean-Luc Boucher

Rapporteur : Pr. Jean-Jacques Girerd

Rapporteur : Pr. Bruno Guigliarelli

Co-directeur de thèse : Dr. Tony Mattioli

Co-directeur de thèse : Dr. Vincent Nivière

Mots-clés :

Stress superoxide, centre mononucléaire à fer non héminique, spectroscopie Raman de résonance, pouvoir électrodonneur du soufre, Fe3+-η2-peroxo et Fe3+-hydroxyde