Direction des sciences du vivant

Il y a une dizaine d’années, des nouvelles flavoenzymes hydroxylases flavine-dépendantes à deux composants ont été identifiées chez certains microorganismes. Le rôle physiologique de ces enzymes est maintenant bien connu. Elles sont impliquées dans les processus de biosynthèse et de biodégradation d’une multitude de molécules organiques. Ces hydroxylases sont composées de deux enzymes distinctes. La premières est une flavine réductase qui catalyse la formation de flavine réduite nécessaire au fonctionnement de la seconde enzyme, une monooxygénase flavine-dépendante.
Au début de notre projet, le mécanisme enzymatique de ces nouvelles hydroxylases était encore inconnu. Pour comprendre le détail de leur fonctionnement, nous avons choisi d’étudier le système ActVA-ActVB, un nouveau membre de la famille des hydroxylases flavine-dépendantes impliqué dans la dernière étape de biosynthèse de l’actinorhodine, un antibiotique naturel synthétisé par Streptomyces coelicolor. La caractérisation préalable de ActVB avait permis de montrer que cette enzyme était une NADH:FMN oxydoréductase capable de catalyser la réduction du FMN par le NADH selon un mécanisme de type séquentiel ordonné. Nos résultats ont permis d’identifier ActVA-Orf5, une monooxygénase flavine-dépendante capable d’utiliser la flavine réduite par ActVB pour catalyser l’hydroxylation du précurseur de l’actinorhodine, la DHK. Le mécanisme de transfert de flavine entre les deux protéines a été étudié. Pour cela, les constantes de dissociation du FMN_ox et FMN_red vis-à-vis de ActVA et ActVB ont été déterminées. Nos donnés montrent clairement qu’à l’état réduit, la flavine est bien plus affine pour la monooxygénase ActVA que pour la réductase ActVB alors qu’à l’état oxydé, elle possède une meilleure affinité pour la réductase que pour la monooxygénase. Cette différence d’affinité permet d’orienter le transfert de flavine d’une protéine à l’autre sans nécessiter d’interaction entre les deux protéines. Nons avons montré de plus que ActVA avait la capacité de stabiliser un intermédiaire activé de l’oxygène, une espèce électrophile nommée C(4a)-hydroperoxyflavine, au sein de son site actif. Cet intermédiaire réagit très rapidement avec la DHK nucléophile pour former son analogue hydroxylé : la DHK-OH. En accord avec ce mécanisme, il semble que le pouvoir nucléophile du substrat est très important pour cette réaction car seule la forme à deux électrons de DHK (hydroquinone) est hydroxylée. D’autre part, ActVa ne semble pas être très spécifique car elle parvient également à catalyser l’hydroxylation de l’énantiomère de la NNM-A et de l’analoque lactonique de la NNM-A, la NNM-D. Finalement le système ActVA-ActVB n’a pas la capacité de dimériser la DHK-OH pour former l’actinorhodine et l’enzyme intervenant dans la dernière étape de cette biosynthèse reste à Identifier.