Bien que les microtubules (MTs) soient intrinsèquement dynamiques, de nombreux types cellulaires contiennent des MTs stables résistants à des conditions dépolymérisantes comme l’exposition au froid ou à des drogues antimicrotubulaires. Les neurones, en particulier, contiennent des effecteurs capables de bloquer complètement la dynamique microtubulaire.
Des travaux antérieurs du laboratoire ont montré que cette stabilisation était due à l’association aux MTs neuronaux de protéines régulées par la calmoduline, les protéines STOP. Deux isoformes neuro-spécifiques ont été caractérisées : une isoforme embryonnaire (E-STOP, 88 kDa) et une isoforme adulte (N-STOP, 115 kDa) [Bosc et al., 1996, Guillaud et al., 1998]. Ces deux isoformes neuronales en s’associant aux MTs les stabilisent et ralentissent leur dynamique. L’étude structure-fonction des protéines STOP a permis la définition de domaines fonctionnels d’interaction avec les MTs et avec la calmoduline [Bosc et al., 2001]. L’ensemble des modules de liaison aux MTs sont chevauchants avec les sites d’interaction de la calmoduline.
Les protéines de la famille des STOP
 Les protéines de la famille des STOP |
 Les souris déficientes en STOP |
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Les souris STOP KO sont dépourvues de MTs stables neuronaux comme non neuronaux. Cette modification spectaculaire de la stabilité des MTs n’a pas de conséquences catastrophiques pour l’organogenèse et la viabilité des souris, et nous n’avons pas observé de défauts anatomiques évidents dans le système nerveux des souris STOP KO [Andrieux et al., 2002]. Par contre, ces souris présentent des défauts synaptiques multiples qui affectent la plasticité synaptique à court et long terme, dans les neurones glutamatergiques de l’hippocampe, défauts associés à une forte réduction du pool de vésicules synaptiques.
Ces défauts synaptiques sont associés avec des troubles multiples et sévères du comportement, avec désorganisation de l’activité, anxiété, retrait social sévère et défaut complet de capacité à materner. Les souris STOP KO présentent une hyperactivité locomotrice, avec réponse augmentée aux stress modérés. Cette hypermotricité est corrigée par les neuroleptiques et exagérée par l’administration d’amphétamines. Ces troubles comportementaux sont considérés comme traduisant une hyperdopaminergie. Des mesures neurochimiques ont montré une hyperréactivité dopaminergique des souris STOP KO, affectant spécifiquement le système limbique, due à une hypersécrétion de dopamine, en l’absence de défauts de recapture ou d’autorégulation [Brun et al., 2005]. Les souris STOP KO présentent également des troubles du filtrage de l’information sensori-motrice (Pre Pluse Inhibition, PPI), troubles également présents chez les patients schizophrènes [Fradley et al., 2005]. L’ensemble des troubles des souris STOP KO sont améliorés par un traitement aux neuroleptiques [Andrieux et al., 2002, Brun et al., 2005, Fradley et al., 2005]. Ces drogues sont de puissants antipsychotiques, utilisées principalement dans la schizophrénie. Cette sévère affection psychiatrique est actuellement considérée comme une maladie de la synapse et les souris STOP KO sont un modèle très intéressant pour étudier l’origine et le traitement de la schizophrénie. Globalement, ces résultats montrent qu’un défaut affectant le système microtubulaire peut induire des troubles de la neurotransmission considérés comme d’importance centrale dans la schizophrénie. Ces observations prennent une valeur particulière dans le contexte d’études récentes qui montrent que des gènes liés à la schizophrénie chez l’homme s’avèrent coder pour des protéines microtubulaires (DISC1) [Callicott et al., 2005, Morris et al., 2003, Owen et al., 2005]. De plus, l’étude des souris STOP KO a montré que des anomalies touchant probablement à la dynamique microtubulaire peuvent affecter la transmission synaptique et le comportement. Nous nous sommes demandés si, en retour, des drogues agissant sur la dynamique microtubulaire pourraient agir sur la transmission synaptique et se comporter comme des anti-psychotiques. Nous avons testé les épothilones, des drogues analogues au taxol capables de franchir la barrière hémato-méningée. Les épothilones, comme le taxol, sont à doses suffisantes des antimitotiques. Les épothilones sont actuellement en cours d’introduction sur le marché, en cancérologie [Galsky et al., 2005, Hofle and Reichenbach, 2005, Kolman 2004, Kolman 2004]. Ces drogues se sont avérées avoir, à des doses au moins 100 fois plus faibles que celles utilisées pour inhiber la croissance tumorale, une action absolument remarquable sur les troubles synaptiques et comportementaux présentés par les souris STOP KO, sans effet secondaires apparents. Ainsi, des drogues microtubulaires peuvent affecter la transmission synaptique et le comportement [Andrieux et al., 2006]. Sur cette base, nous avons déposé un brevet concernant l’utilisation des épothilones dans les maladies mentales supposées impliquer des troubles de la connectivité neuronale, en l’absence de processus dégénératif ou prolifératif (schizophrénies et autisme). |
| Les protéines STOP et la synapse |
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L’étude des souris STOP KO a indiqué un rôle probable et intrigant des STOP à la synapse. En effet, il est étonnant qu'une protéine associée tout au long des MTs neuritiques s'avère être importante pour la fonction synaptique, en dépit de l'absence apparente de MTs dans les terminaisons nerveuses. Il y a cependant des évidences biochimiques et protéomiques de la présence des protéines STOP dans les compartiments synaptiques (Andrieux et al., 2002, Peng et al., 2004). Nous avons recherché des mécanismes capables de favoriser la dissociation des STOP des MTs et leur re-localisation dans les structures synaptiques. Les évènements de plasticité synaptique comme la LTP sont connus pour impliquer la protéine kinase calcium/calmodulin-dependent II (CaMKII). La protéine STOP contient plusieurs sites potentiels de phosphorylation par la CaMKII. Nous avons montré que la protéine STOP est phosphorylée par CaMKII sur au moins trois sites indépendants (S139, S198, S491) et que la STOP phosphorylée ne lie plus les MTs. Les formes phosphorylées de STOP se localisent avec les structures riches en actine dans des neurones en culture et lient F-actine polymérisée in vitro. Ainsi, la phosphorylation des protéines STOP par la CaMKII peut permettre leur association avec l'actine synaptique et potentiellement jouer un rôle dans la plasticité synaptique [thèse de Julie Baratier, 2002-2004, dirigée par A. Andrieux ; Baratier et al., 2006].
Afin de mieux comprendre la fonction des STOP à la synapse, nous a recherché des partenaires des STOP en utilisant le système double hybride. Nous avons identifié deux partenaires potentiels, les protéines Tctex-1 et Arc. Tctex-1 est une des trois chaînes légères de du moteur moléculaire dynéine impliquée dans le choix des cargos lors du transport rétrograde ou apical. La protéine Arc, (Activity regulated cytoskeleton associated protein) est impliquée dans la LTP et d'autres formes de neuroplasticité. L'étude structure-fonction des protéines STOP a permis de mettre en évidence des modules fonctionnels de liaison et de stabilisation des MTs : les modules "Mc" et "Mn" [Bosc et al., 2001]. La caractérisation de ces modules a permis d'identifier dans les banques de données une protéine de 21kd contenant un module Mn, protéine que nous avons appelée SL21 pour STOP-Like de 21Kd. La partie N-terminale de SL21 présente également une très forte homologie avec la partie N-terminale de N-STOP. Nous avons montré que SL21 est capable de se lier à la calmoduline et aux MTs in vitro. En revanche, un mutant de SL21, qui ne contient plus le module Mn ne stabilise pas les MTs indiquant que ce module décrit dans les protéines STOP comme capable de stabiliser les MTs possède les même propriétés au sein de SL21. On peut donc considérer SL21 comme une nouvelle MAP (Microtubule Associated Protein). Après transfection transitoire de SL21 dans les cellules NIH-3T3 nous observons une localisation différente en fonction du taux de transfection. Une partie du réseau microtubulaire est marqué après une très forte expression de SL21. En revanche, à faible taux d’expression la protéine est localisée au niveau de l’appareil de Golgi. SL21 semble donc avoir une affinité duale à la fois pour les MTs et pour l’appareil de Golgi. Grâce à des mutants de délétion nous avons monté que la partie N-terminale de SL21 (homologue aux protéines STOP) était responsable de l’interaction avec l’appareil de Golgi, interaction qui requière trois cystéines indiquant une probable palmitoylation de SL21 nécessaire à l’ancrage au Golgi. Au niveau endogène, SL21 est strictement neuronale, présente dans les neurones en culture au niveau de l’appareil de Golgi somatique ainsi que dans des vésicules le long des neurites. Ces résultats laissent imaginer que SL21 pourrait être associée au Golgi dendritique et jouer un rôle au cours du trafic et/ou dans le positionnement du Golgi le long des dendrites, utilisant sa capacité à lier l’appareil de Golgi et les MTs (Gory-Fauré et al., 2006). |
| Références bibliographiques |
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