Direction des sciences du vivant

Les neurones contiennent une abondante population de microtubes stables résistant à la dépolymérisafidn induite par le froid. Cette stabilité est induite par l'association des microtubules avec deux effecteurs majeurs régulés par le complexe Ca²⁺/calmoduline et la CaM Kinase II : les isoformes E et N-STOP (Early et adult Neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). La phosphorylation de la protéine STOP par la CaMKII, enzyme clé de la plasticité synaptique, inhibe notamment sa capacité à lier les microtubules. L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne une dérégulation des synapses glutamatergiques de l'hippocampe, avec diminution massive de la densité des vésicules pré-synaptiques et une altération des mécanismes de plasticité synaptique à court et à long terme. Ces défauts synaptiques sont associés à des troubles sévères du comportement chez les souris STOP-/-.
Dans un premier temps, afin de poursuivre les travaux concernant la présence de la protéine STOP à la synapse et sa régulation par phosphorylatian, nous avons étudié la localisation cellulaire de la STOP phosphorylée dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe : elle se trouve enrichie spécifiquement au niveau des spicules dendritiques et des points de branchements axonaux et co-localise avec le réseau d'actine cortical sous-membmnaire. Nous avons également montré que la STOP co-sédimente avec I'actine F polyrnérisée in vitro, quelle que soit sa régulation par la CaMICII. STOP phosphorylée co-localise partiellement avec des marqueurs pré- et post-synaptiques. La phosphorylatian de STOP par la CaMKII permet donc sa dissociation du réseau microtubulaire et sa re-localisation vers des structures synaptiques comme le cytosquelette cartical d'actine.
Dans la deuxième partie de ce travail, afin de recueillir des informations susceptibles de caractériser la fonctionnalité de la STOP à la synapse, nous avons identifié des partenaires neuronaux in vivo par la technique du double-hybride chez la levure. Trois de ces partenaires potentiels ont été confirmés : la protéine Tctexl, à ta fais chaîne légère du moteur moléculaire dynéine assurant le choix des cargos lors du transport rétrograde le long des microtubules mais également impliquée dans la crroissance neuritique et l'adressage au bouton synaptique de canaux calciques sensibles au voltage, la proteine Arc, élément clé de l'élément post-synaptique impliqué dans des mécanismes de plasticité synaptique, et la protéine Nsg2 locatisée spécifiquement à l'appareil de Golgi des cellules neuronales et de fonction indéterminée pour le moment.
Nous nous sommes ensuite focalisés ptuo particulièrement sur le partenaire Tctexl en confirmant l'interaction avec la STOP par des expériences de CO-localisation par immunofluarescence dans des cellules de mammifères, de co-immunoprécipitation à partir de lysats de cellules transfectées, de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET). Par l'emploi de mutants délétés, le site d'interaction de STOP avec Tctexl a été ciblé au niveau de sa partie carboxy-terminale, et plus précisément dans un module de liaison aux microtubutes.
Si Tctexl est indispensable à l'acheminement de canaux calciques nécessaires à l'exocytose de neurotransmetteurs et donc la transmission synaptique, nous avons également montré que l'absence de son partenaire STOP entraînait une réduction de la densité de courants calciques transitant à travers des canaux spécifiques de la neurotransmisslon, couplée à une diminution du nombre total des canaux dans les prolongements neuritiques. L'absence de STOP est également responsable d'un défaut du transport rétrograde neuronal, ce qui permet de relier la STOP à la fonctionnalité motrice de la dynéine cytoplasmique.
En interagissant avec une multitude de partenaires différents aux fonctionnalités bien distinctes, la protéines STOP exercerait très probablemenl un rôle intégrateur dans I'orgyisation fonctionnelle de la synapse.