Direction des sciences du vivant

Chercheurs et enseignants-chercheurs :
Laurent Blanchoin, CNRS
Rajaa Paterski-Boujemaa, UJF
Jean-Louis Martiel, Inserm
Alphée Michelot, CNRS
Virginie Stoppin-Mellet, UJF
Manuel Théry, CEA (Site Web)
Marylin Vantard (CNRS)

Étudiants et post doctorants :
Didier Portran
Timothée Vignaud, thèse
Théo Cambier, thèse
Rémi Galland, post-doc
Tobias Klar, post-doc
Agnieszka Kawska, post-doc
Gaëlle Letort, thèse

Ingénieurs :
Jérémie Gaillard
Christophe Guérin
Fabrice Senger

Nos études visent à identifier et formuler les grands principes biophysiques gouvernant la dynamique d'organisation du cytosquelette (filaments d'actine, microtubules) au cours de la morphogénèse cellulaire en intégrant des informations allant de l'échelle de la molécule unique à celle de la cellule.

La morphogenèse regroupe l'ensemble des mécanismes qui dirigent la croissance et le développement des organismes vivants. Au cours de la construction de l'organisme, des structures spatiales régulières sont formées. Elles apparaissent à l'échelle subcellulaire comme à l'échelle des tissus. Ces structures, qu'elles soient stables ou transitoires, sont surtout extrêmement reproductibles. L'apparition systématique de ces états d'équilibres suggère qu'il existe des lois d'organisation sous-jacentes. D'un point de vue expérimental, la mise en évidence de ces lois physiques qui régissent aussi bien l'organisation du cytosquelette dans les cellules que des cellules dans les tissus est rendue impossible de par la complexité des systèmes. Les constituants sont trop nombreux, ils interagissent de façons multiple et stochastique au sein d'environnements variables et fluctuants. Notre équipe a mis en place plusieurs approches pour réduire cette complexité et permettre aux lois de se manifester de façon explicites.

Une approche, que l'on pourrait qualifier de « bottom-up », consiste à partir d'éléments extrêmement simples et à les complexifier jusqu'à approcher la composition d'une cellule. Les constituants élémentaires, les polymères du cytosquelette et les protéines qui y sont associées, sont séparés, purifiés puis remis en présence de façon contrôlée. Ils peuvent alors s'auto-assembler pour former des structures organisées. Il reste à observer et décrire ces structures le plus précisément possible afin d'identifier les paramètres critiques participant à leur assemblage. Nous avons appliqué cette stratégie à l'étude des deux principaux composants du cytosquelette, l'actine et les microtubules. En utilisant des techniques d'imagerie appropriées, il est possible d'observer la dynamique d'assemblage de ces réseaux du cytosquelette à l'échelle de la molécule unique et ainsi d'en mesurer les propriétés physiques.

Une des stratégies que nous utilisons couramment est de greffer sur des objets inertes (par exemple des billes de polystyrène) des protéines (ie : nucléateurs d'actine) qui vont permettre d'initier l'assemblage des filaments d'actine au contact de ces objets. On peut alors observer en temps réel, le nombre, la taille et la forme des filaments en fonction des conditions biochimiques imposées. On peut également observer la formation de super-structures comme l'assemblage des filaments en faisceaux parallèles ou en réseaux denses et enchevêtrés. Ces structures existent effectivement au sein des réseaux complexes que l'on peut observer dans les cellules (fibres de stress, filopodes, lamellipodes), mais les conditions qui induisent leur formation sont encore inconnues.



Formation d'un faisceau d'actine in vitro par le « zippering » de filaments individuels sous l'action des formines (Michelot et al., 2007). Les filaments d'actine, s'assemblant au voisinage de la lame de verre, sont observés en imagerie à onde évanescente (TIRF) qui permet d'isoler optiquement et de suivre la dynamique d'événements fluorescents. Les flèches indiquent les filaments individuels qui vont ensuite être rassemblés pour former des faisceaux. Voir film 01.

Dans ces structures, des contraintes mécaniques plus importantes qu'au sein de filaments individuels peuvent être développées. Selon leurs orientations et la localisation de leurs points d'application, ces contraintes peuvent mettre en mouvement les éléments avec lesquels ils interagissent. Par exemple, nous avons pu identifier les conditions, dans lesquelles l'augmentation de la dynamique des filaments, leur polymérisation et leur dépolymérisation, au cours de croissance isotrope autour d'objet inerte (bille de polystyrène) peut induire une brisure de symétrie du gel d'actine ainsi formé. Cette brisure symétrie se matérialise par le regroupement des filaments en faisceaux d'un seul côté de la bille et la propulsion de celle-ci. Sans moteur moléculaire, la simple croissance des filaments en une structure particulière, suffit à générer des forces importantes. Ces forces existent donc à l'intérieur des cellules où elles participent à la déformation des membranes cellulaires et au déplacement d'organites intracellulaires.



Les filaments individuels d'actine poussent à partir d'une bille greffée avec un facteur de nucléation de l'actine (les formines). Les filaments forment des faisceaux qui s'associent entre eux pour former des assemblages de plusieurs dizaines de filaments. Les contraintes au sein de ces super-structures en cours de croissance sont si importantes qu'elles peuvent les forcer à se tordre. Michelot et al., 2007. Voir film 02.


La croissance des faisceaux d'actine contre la bille suffit à déplacer la bille sur des distances importantes à l'échelle de la cellule. Michelot et al., 2007. Voir film 03.

Les microtubules sont des éléments tubulaires formés par l'agencement d'hétérodimères α et ß de tubuline qui s'assemblent et se désassemblent, conférant aux microtubules des propriétés dynamiques intrinsèques. In vitro ils ont la capacité de s'autoassembler spontanément au delà d'une certaine concentration en dimères de tubuline. L'organisation des microtubules en réseaux structurés et complexes est liée à l'activité de protéines associées aux microtubules (MAPs) capables de moduler leur comportement dynamique (stabilisation, déstabilisation,…) et d'induire des associations latérales entre microtubules (« zippering » des microtubules). Suite à ces modifications de leurs caractéristiques physiques, les microtubules peuvent s'auto-organiser en super-structures : des faisceaux parallèles ou anti-parallèles ou même des réseaux en étoile ou en vortex. Nous étudions le rôle précis de certaines de ces protéines, en particulier celles impliquées dans la déstabilisation des microtubules katanine (Stoppin-Mellet et al., 2006) et dans leur association en faisceaux.

In vitro, l'addition de protéines de la famille des MAP65 (MAP65-1 et MAP65-5 de plantes, apparentées à PRC1 de mammifères et Ase1p de levure) à des microtubules a pour effet d'induire des associations latérales entre des microtubules de polarité opposées induisant la formation de faisceaux denses.



Les microtubules seuls (assemblés à partir de tubuline fluorescente) (a) n'interagissent pas entre eux et ne forment aucune structure. L'addition d'AtMAP65-1 induit le zippering de microtubules individuels conduisant à la formation de faisceaux (f). Différents domaines d'AtMAP65-1, localisées dans la partie N-terminale et centrale de la protéine (c-e) induisent également la formation de faisceaux alors que le domaine C-terminal ne présente pas cette propriété mais correspondant au domaine de liaison aux microtubules (b). (Gaillard et al., 2008).

L'activité, caractérisée in vitro de ces protéines a été ensuite étudiée sur des systèmes modèles. Elle nous a permis notamment d'expliquer leur rôle dans l'auto-organisation de réseaux complexes de microtubules au cours de la morphogenèse au sein de cellules isolées ou dans des organismes entiers. Les réseaux de microtubules des cellules de plantes étant essentiellement composés de réseaux de faisceaux de microtubules auto-assemblés et dispersés dans le cytoplasme, ces cellules représentent un puissant système expérimental pour étudier l'organisation de réseaux de faisceaux linéaires stables ou dynamiques non connectés a un centre organisateur de microtubule (MTOC) tel que le centrosome. Ces spécificités se retrouvent également dans de nombreuses cellules animales différenciées (myotubes, cellules épithéliales polarisées, cellules neurales, etc) où les microtubules n'irradient pas toujours individuellement dans le cytoplasme à partir de leur centre de nucléation mais sont organisés en réseaux non connectés au MTOC.

Une autre approche, que l'on pourrait qualifier de « top-down», consiste à partir du complexe, la cellule, et de tenter de le simplifier. Une des sources principales de complexité apparente dans les cellules vient des fluctuations qui agitent son cytosquelette et de la variabilité des conditions dans lesquelles se trouvent les cellules. Ainsi les architectures de deux cellules, côte à côte dans une boite de culture cellulaire sont à peine comparables. L'absence de contrainte spatiale laisse les fluctuations internes des cellules guider leur architecture aléatoirement. Nous avons donc mis au point différentes techniques de microstructuration des surfaces de culture cellulaire afin de contrôler avec précision la géométrie du microenvironnement cellulaire. En réponse à ces conditions limites données, les cellules se comportent de façon reproductible. Les lois d'organisation qui régissent ces comportements reproductibles deviennent donc manifestes. L'utilisation de tels supports permet en outre de faire des mesures automatisées sur de grands nombres de cellules et, donc, d'effectuer des statistiques fiables.
Il est assez intuitif de comprendre que la distribution spatiale des points d'ancrage de la cellule joue un rôle déterminant sur l'ensemble de l'architecture de la cellule. Nous avons montré également que cette géométrie de l'ancrage des cellules oriente leur polarité en interphase ainsi que leur division.

Ces travaux ont été réalisés par M Théry au cours de son doctorat chez Michel Bornens à l'Institut Curie (Paris).

La taille des cables d'actine et des adhérences cellulaires s'adapte avec précision à la géométrie des zones d'ancrage de la cellule (Théry et al., 2006).	L'orientation de la polarité des cellules, révélée par les position respectives du noyau (rouge, en bas), de l'appareil de Golgi (bleu) et du centrosome (vert), s'adapte à la distribution spatiale des adhérences et à l'architecture de l'actine (Théry et al., 2006).	L'axe de divisions des cellules est très précisément orienté en fonction de la distribution spatiale des adhérences cellulaires (Théry et al., 2005).

Ces travaux ont été réalisés par M Théry au cours de son doctorat chez Michel Bornens à l'Institut Curie (Paris).

Ces observations, ces descriptions ne font réellement progresser la compréhension des systèmes étudiés que lorsqu'elles permettent de définir un modèle physique complet. Le contrôle précis des conditions expérimentales (biochimiques et géométriques), la précision des mesures et la reproductibilité des événements moléculaires et cellulaires permettent d'identifier les paramètres critiques impliqués et de proposer des modèles physiques des lois morphogénétiques (Michelot et al., 2007 ; Roland et al., 2008 ; Théry et al., 2007). Ces modèles peuvent alors être simulés numériquement. Les simulations constituent des sortes d'expériences numériques dont le résultat permet de valider les hypothèses formulées à partir des observations précédentes. Alternativement, les simulations peuvent reposer sur des paramètres avérés et servir à observer le comportement du système dans des conditions inédites. Elles trouvent alors un caractère prédictif unique.

Ce schéma illustre l'effet de la fragmentation des filaments d'actine au cours de leur croissance isotrope et l'induction d'une brisure de symétrie qui aura pour effet d'assembler les filaments selon une orientation préférentielle (Michelot et al., 2007).	Ce schéma illustre l'hypothèse selon laquelle seul les microtubules astraux qui contactent les fibres de rétraction (actine) sont mis sous tension. Ceci a pour effet de faire tourner le fuseau mitotique et d'orienter la division (Théry et al., 2007).

Les simulations numériques du modèle ci-dessus montrent qu'il permet effectivement d'expliquer le lien entre fragmentation et croissance asymétrique (Michelot et al., 2007).	Les simulations numériques du modèle ci-dessus montrent qu'il permet effectivement d'expliquer comment la mise sous tension de certains microtubules oriente les divisions cellulaires (Théry et al., 2007).

• Théry M and Piel M
Adhesive micropatterns for cells: A microcontact printing protocol.
Cold Spring Harbor Protocols, 2009

• Azioune A, Storch M, Bornens M, Thery M and Piel M
Simple and rapid process for single cell micro-patterning.
Lab On Chip, 2009, 9: 1640-1642

• Gaillard J, Neumann E, Van Damme D, Stoppin-Mellet V, Ebel C, Barbier E, Geelen D and Vantard M
Two microtubule-associated proteins of Arabidopsis MAP65s promote anti-parallel microtubule bundling.
Molecular Biology of the Cell, 2008, 19(10): 4534-4544

• Roland J, Berro J, Michelot A, Blanchoin L and Martiel JL
Stochastic severing of actin filaments by ADF/cofilin controls the emergence of a steady dynamical regime.
Biophysical Journal, 2008, 94(6): 2082-2094

• Fink J, Théry M, Azioune A, Dupont R, Chatelain F, Bornens M and Piel M
Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques.
Lab On Chip, 2007, 7: 672-680.

• Théry M, Jiménez-Dalmaroni A, Racine V, Bornens M and Jülicher F
Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.
Nature, 2007, 447(7143): 493-496

• Michelot A, Berro J, Guerin C, Boujemaa-Paterski R, Staiger CJ, Martiel JL and Blanchoin L
Actin-filament stochastic dynamics mediated by ADF/Cofilin.
Current Biology, 2007, 17(10): 825-833

• Stoppin-Mellet V, Gaillard J and Vantard M
Katanin's severing activity favors bundling of cortical microtubules in plants.
Plant Journal, 2006, 46(6): 1009-1017

• Wicker-Planquart C, Stoppin-Mellet V, Blanchoin L and Vantard M
Interactions of tobacco microtubule-associated protein MAP65-1b with microtubules.
Plant Journal, 2004, 39(1): 126-134

• Blanchoin L, Amann KJ, Higgs HN, Marchand JB, Kaiser D and Pollard TD
Direct observation of dendritic actin filaments networks formed by Arp2/3 complex and Wasp/Scar proteins.
Nature, 2000, 404: 1007-1011

Les observations que nous faisons vont de la molécule unique aux groupes multicellulaires. Les films enregistrés ont des intervalles temporels de l'ordre de la dizaine de millisecondes à la dizaine de minutes pour des durées totales pouvant aller jusqu'à plusieurs jours. De fait nous utilisons différents types de microscopes afin qu'ils soient parfaitement adaptés au type d'acquisition souhaité.
Voici un descriptif succinct des postes que nous utilisons quotidiennement au laboratoire :

• IMAGERIE EN ONDES EVANESCENTES, ou en reflection totale : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)
- Analyse des dynamiques d'interactions des protéines en FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).

Montage TIRF

Ce poste associe l'imagerie TIRF avec un prisme et l'épi-fluorescence classique.

Montage TIRF + FRAP motorisé

Les lasers sont envoyés sur des miroirs galvanométriques ce qui permet d'envoyer les lasers sur la zone d'intérêt dans le champ optique.
La caméra permet d'imager simultanément deux couleurs distinctes sur des moitiés différentes du capteur.
La mise au point est ajustée automatiquement par mesure laser (Nikon Perfect Focus System).

Éléments principaux
Microscope Nikon TE2000 inversé
Caméra Ropper Quantum EM:512SC
Excitation :
- Laser TIRF 491nm, 561nm
- Lasers FRAP 491nm 561 nm
- lampe Xcite
Pilotage : Métamorph

• IMAGERIE CELLULAIRE sur des échantillons vivants ou fixés.

Vidéo-microscope

Ce poste est partagé avec le laboratoire Biopuces et Génomique Fonctionnelle.

Le microscope est dans une enceinte à 37°C contrôlée en humidité et en CO₂.
La platine motorisée permet de suivre plusieurs positions au cours du temps (200 pour un intervalle de 10 min)
La motorisation du statif permet de suivre plusieurs fluorophores et la contraste de phase au cours du temps.

Imagerie d'échantillons fixés

Ce poste entièrement motorisé permet de d'imager à haute résolution un réseau de position en XY à haute résolution et de faire de l'imagerie 3D suivie d'une déconvolution des images.

Le « micropatterning » développé et utilisé dans notre équipe est un traitement de surface permettant de greffer des protéines d'interet sur des motifs de taille micrométrique et d'empêcher le dépôt de ces protéines en dehors de ces motifs. Nous travaillons principalement sur des supports plans. L'objectif de cette structuration de surface est de contrôler spatialement l'adhérence des cellules de façon à imposer la géométrie de leur patron d'adhérence et donc leur forme. Il existe de très nombreuses méthodologies permettant de faire du micropatterning de protéines mais toutes ne permettent pas d'y déposer des cellules et peu sont capables de contraindre efficacement les cellules les plus contractiles sur plusieurs jours (Fink et al., 2007). Nous nous efforçons d'améliorer et de simplifier les protocoles de micropatterning pour cellules de façon à les rendre accessibles aux laboratoires de biologie.



Nous avons commencé par développer un processus efficace de micropatterning par « micro-contact printing » ou impression par microcontact. Cela consiste à fabriquer un moule en photolithographie de façon à produire un tampon en silicone dont le relief permettra d'imprimer les protéines adsorbées à la surface du tampon sur le support de culture cellulaire (Théry and Piel, 2009).