Life Sciences Division

Figure 1

Le deuxième concerne la biotine synthase (BioB) qui catalyse la formation du cycle thiophane de la biotine (Figure 2). La biotine (vitamine H) est le cofacteur essentiel de certaines décarboxylases et a une importance économique majeure dans les domaines de la santé et des biotechnologies. Les besoins mondiaux sont actuellement de 30 t/an produites chimiquement par un procédé comprenant une dizaine d'étapes.

Figure 2

Malgré des efforts soutenus depuis plus de 15 ans ces 2 systèmes sont incapables de fonctionner de façon catalytique in vitro et ce problème constitue l'obstacle principal à la production de biotine par voie biologique.

Les objectifs du projet sont les suivants :

1. Découvrir les conditions permettant à ces systèmes de fonctionner de façon catalytique in vitro. Il est possible que des partenaires protéiques, non encore identifiés, soient requis pour cela. Nous comptons explorer cette hypothèse par des techniques de biologie moléculaire (double hybride) et de biochimie (TAP-TAG, fractionnement).
   
   
2. Identifier le donneur direct de soufre. À ce jour, deux hypothèses sont proposées. Dans la première, un sulfure pontant d'un deuxième centre Fer-Soufre, ([2Fe-2S] pour BioB et [4Fe-4S] pour MiaB) serait le précurseur direct du soufre inséré dans le substrat. Cette proposition intéressante en ce qu'elle établirait une nouvelle fonction pour ces cofacteurs métalliques reste néanmoins à vérifier. La deuxième hypothèse est basée sur la présence de soufre de type sulfane (S⁰ et/ou S^-1) dans ces protéines sous forme de persulfure/polysulfure qui pourrait réagir avec le substrat activé par voie radicalaire.
   Résoudre cette question devrait donner des clés nouvelles pour le premier objectif. On peut effectivement penser que l'identification du donneur de soufre permettrait de mieux définir les conditions de régénération de l'enzyme pour un deuxième cycle catalytique.

Le travail au laboratoire porte sur l'étude de ces mécanismes à l'aide de protéines purifiées et de mutants dirigés, en utilisant un grand nombre de techniques spectroscopiques et biochimiques.

Ce projet est basé sur les connaissances accumulées depuis plus de 15 ans sur une enzyme essentielle du métabolisme anaérobie : la ribonucléotide réductase de classe III qui, chez les anaérobes catalyse la formation des 4 desoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs) nécessaires à la synthèse et la réparation des chaînes d'ADN. La RNR III contient dans sa forme active un radical glycinyle essentiel à son activité. Ce radical active le ribonucléotide substrat qui peut alors être réduit en 2' du ribose. Ces enzymes sont particulièrement intéressantes à étudier du point de vue des mécanismes allostériques qui dirigent la synthèse d'un des dNTPs plutôt qu'un autre mais aussi du point de vue de l'utilisation de la chimie radicalaire en biologie. Comment des entités radicalaires hautement réactives sont générées, contrôlées et acheminées vers leur cible ?

Figure 3 : Le site « Zn » de la RNR III du bactériophage T4 (D. Logan et al., PNAS, 2003)

Le projet a pour ambition de cristalliser la RNR III d'un organisme thermophile, T. maritima, sous forme du complexe ß entre la réductase et son enzyme activatrice. Les études récentes réalisées sur l'enzyme de E. coli montrent que la formation et la stabilité du radical glycinyle est contrôlée par la structuration d'un site Zn(Cys)