La compréhension des mécanismes catalytiques de systèmes enzymatiques originaux en relation avec leurs fonctions au sein des cellules représente un des défis majeurs de la biologie moderne. Dans le cadre de cette problématique, mes recherches portent sur l'étude structure-activité des deux systèmes enzymatiques suivants :
• Une métalloenzyme appelée superoxyde réductase, impliquée dans la lutte contre le stress oxydant
• Un système enzymatique flavine dépendant intervenant dans la biosynthèse d'un antibiotique en catalysant une réaction de monooxygénation.
Superoxyde réductase - Biosynthèse de l'actinorhodine
- Hydrogenases modelisation
- Iron-sulfur cluster biosynthesis
- Superoxyde réductase - Biosynthèse de l'actinorhodine
- Formation de la liaison C-S
- Métaux toxiques et biosynthèse des centres [Fe-S]
- Maturation des hydrogénases à fer
- Formation of binuclear iron centers and Coenzyme Q biosynthesis
- Hydrogen photoproduction
- Photofermentation of organic compounds and biological production of hydrogen
- Publications
 Responsable |
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| Superoxyde réductase SOR : mise en évidence d’une nouvelle activité enzymatique impliquée dans la détoxication du radical superoxyde |
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L’utilisation de l’oxygène par les organismes vivants s’accompagne irrémédiablement de la formation d’espèces toxiques, comme le radical superoxyde (O2.-) ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Les organismes vivants sont dotés de tout un arsenal enzymatique (superoxyde dismutases, catalases, peroxydases) permettant l’élimination de ces espèces toxiques et dont l’efficacité est essentielle à leur développement au sein de l’atmosphère terrestre. On sait d’ailleurs qu’une insuffisance au niveau de ces systèmes protecteurs peut être à l’origine d’un certain nombre de maladies graves chez l’homme, souvent associées à des processus de dégénérescence cellulaire. La connaissance et la compréhension de ces mécanismes antioxydants constituent donc un enjeu essentiel en matière de santé publique. O2.- + O2.- + 2 H+ Très récemment, notre groupe a découvert que certaines bactéries sont dotées d'un autre système enzymatique permettant l'élimination du superoxyde par une réaction différente de celle catalysée par les superoxyde dismutases. Il s'agit de la superoxyde réductase (SOR), éliminant le superoxyde par réduction : O2.- + 1 électron + 2 H+
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Dans ce but, nous développons une approche pluridisciplinaire, associant des compétences en biochimie des métalloprotéines (surexpression de protéine, mutagénèse dirigée), en cinétique enzymatique (état stationnaire et cinétique rapide), en spectroscopies (UV-visible, RPE, résonance Raman), en génétique microbienne (études physiologiques, délétion de gènes, expression hétérologue) et en physique (radiolyse pour une production spécifique de superoxyde, cristallisation et diffraction des RX), avec pour objectif de mieux comprendre le mécanisme de fonctionnement de ce nouveau système.
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| Nouvelle réactivité de la Superoxyde Réductase : Complexe SOR-ferrocyanure |
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Les deux systèmes actuellement décrits pour détoxiquer le radical superoxyde, la superoxyde dismutase (SOD) et la superoxyde réductase (SOR), présentent l'inconvénient de produire du peroxyde d'hydrogène, qui est toxique pour la cellule. Ils doivent être donc être associés dans les cellules à des activités catalases et peroxydase afin de permettre une détoxification totale.
Très récemment, il est apparu que le site actif de la SOR présente la propriété singulière de complexer très spécifiquement une molécule de ferrocyanure Fe(CN)6 (Figure 2). Ce complexe très stable est sans précédant dans le domaine des métalloprotéines.  Figure 2 : Complexe SOR-ferrocyanure. Le ferrocyanure, véritable cofacteur de la SOR, est fixé au site actif par l'intermédiaire d'un pont cyano et de liaisons hydrogènes entre les CN et plusieurs acides aminés de la seconde sphère de coordination du fer de la SOR.De façon plus surprenante, nous avons montré que la présence de ferrocyanure associée à la SOR modifie de façon importante la réaction de l'enzyme avec le superoxyde. En présence du complexe, la réaction est alors centrée sur l'adduit ferrocyanure, qui devient un véritable cofacteur de la SOR. Le superoxyde est toujours réduit à un électron, comme pour la SOR seule, mais le peroxyde d'hydrogène n'est plus le produit de cette réaction. A la place, on a formation d'un alkylperoxyde, bien moins toxique pour la cellule que le peroxyde d'hydrogène. Ces résultats décrivent pour la première fois une activité de détoxification du radical superoxyde sans production de peroxyde d'hydrogène. L'étude des nouvelles propriétés du complexe SOR-ferrocyanure constitue un des aspects important de nos recherches sur la SOR. Il s'agit notamment de comprendre l'origine de la stabilité du complexe, ainsi que d'étudier en détail son mécanisme réactionnel. |
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| Sélection de publications |
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Bonnot F, Duval S, Lombard M, Valton J, Houee-Levin C and Nivière V
Mathe C, Weill CO, Mattioli TA, Berthomieu C, Houee-Levin C, Tremey E and Nivière V Assessing the role of the active-site cysteine ligand in the superoxide reductase from Desulfoarculus baarsii. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(30): 22207-22216 Molina-Hérédia F, Houée-Levin C, Berthomieu C, Touati D, Tremey E, Favaudon V, Adam V and Nivière V Detoxification of superoxide without production of H2O2: Antioxidant activity of superoxide reductase complexed with ferrocyanide. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2006, 103(40): 14750-14755 Mathé C, Nivière V and Mattioli TA A Fe3+-hydroxide ligation in the superoxide reductase from Desulfoarculus baarsii is associated with pH dependent spectral changes. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(47): 16436-16441 Nivière V, Asso M, Weill CO, Lombard M, Guigliarelli B, Favaudon V and Houée-Levin C Superoxide reductase from Desulfoarculus baarsii: Identification of protonation steps in the enzymatic mechanism. Biochemistry, 2004, 43(3): 808-818 Adam V, Royant A, Nivière V, Molina-Heredia F and Bourgeois D Structure of superoxide reductase bound to ferrocyanide and active site expansion upon X-ray-induced photo-reduction. Structure (Camb), 2004, 12(9): 1729-1740 Nivière V and Fontecave M Discovery of superoxide reductase: An historical perspective. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2004, 9(2): 119-123
Lombard M, Fontecave M, Touati D and Nivière V Reaction of the desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii with superoxide anion. Evidence for a superoxide reductase activity. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(1): 115-121 |
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| Biosynthèse de l'actinorhodine, un antibiotique naturel. Étude d'une nouvelle classe de monooxygénase flavine réductase dépendante |
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Le projet porte sur une famille d'enzymes, les flavines réductases, qui ont été bien étudiées au laboratoire mais dont on connaît mal à l'heure actuelle leur fonction physiologique. Des données récentes de la littérature suggèrent que ces enzymes jouent un rôle important dans certaines voies de biosynthèses, en participant à des réactions de monooxygénation.
Nous essayons actuellement de comprendre le détail du mécanisme de ce nouveau système d'oxydation. Il s'agit de caractériser les propriétés de la monooxygénase fonctionnant de concert avec la flavine réductase et d'étudier son mécanisme catalytique par des techniques de spectrophotométrie UV-visible, de cinétique enzymatique, mutagénèse dirigée et cristallographie des protéines. |
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| Sélection de publications |
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Valton J, Fontecave M, Douki T, Kendrew S G, and Nivière V |
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| Thèses soutenues |
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| Florence Bonnot, 25 novembre 2009, Université J. Fourier Grenoble I Superoxyde réductase : Mécanisme de transfert d’électrons vers le site actif et rôle de la lysine 48 dans la catalyse. [Résumé] [Thèse en ligne] Émilie Tremey, 03 décembre 2009, Université J. Fourier Grenoble I Étude du rôle du ligand axial cystéine du site actif de la superoxyde réductase dans la réactivité avec le superoxyde. [Résumé] [Thèse en ligne] Julien Valton, 1 décembre 2005, Université J. Fourier Grenoble I Réaction d’hydroxylation aromatique catalysée par une hydroxylase flavine-dépendante à deux composants : le système ActVA-ActVB de Streptomyces coelicolor. [Résumé] Christelle Mathé, 27 janvier 2005, Université René Descartes Paris V Études structure-fonction des superoxydes réductases. Mise en évidence de nouvelles espèces intermédiaires au niveau du site actif. [Résumé] Laurent Filisetti, 20 mars 2003, Université J. Fourier Grenoble I Flavine réductases et réactions d'hydroxylation. Étude enzymatique d'ActVB de Streptomyces coelicolor. [Résumé] Murielle Lombard, 19 Janvier 2001, Université J. Fourier Grenoble I Activité superoxyde réductase. Mise en évidence d'une nouvelle activité enzymatique impliquée dans la lutte contre le stress superoxyde. [Résumé] |
H2O2 + O2 (SOD)
