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Institutes/ Institute of life sciences research and technologies (iRTSV)/ Unités / Chimie et Biologie des Métaux (CBM)/ Biocatalysis/ Maturation des hydrogénases à fer

Maturation des hydrogénases à fer



Responsable
 
Dr. Mohamed Atta
Chercheur ingénieur CEA
iRTSV/LCBM
CEA Grenoble
17 rue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
Tel. : (33) 4 38 78 91 15
Fax : (33) 4 38 78 91 24
 
Maturation des hydrogénases à fer : structure et réactivité d'une machinerie protéique
 
Les hydrogénases (H2ase) sont présentent chez de nombreux microorganismes. Elles catalysent l'oxydation réversible de l'hydrogène selon la réaction suivante :

H2 2H+ + 2e-


Les H2ases sont des métalloenzymes appartenant à deux groupes. Les sites actifs des [Ni-Fe]-H2ase contiennent un atome de fer et un atome de nickel, alors que le fer seul est présent dans les [Fe]-H2ase. La structure tridimensionnelle des [Fe]-H2ase a été déterminée montrant que le site actif est un complexe binucléaire de fer unique (Figure). Le caractère remarquable de ce site réside en particulier dans la présence de ligands CO et CN ainsi que d'un ligand dithiolate bidentate et binucléant qui ponte les deux atomes de fer.



Figure 1 : Structure du site actif de l'hydrogénase à fer

On sait aujourd'hui que d'une manière générale la biosynthèse et l'assemblage des métallo-sites sont des processus complexes impliquant des machineries multi-protéiques. Il en est de même pour la biosynthèse du site des hydrogénases. En 2004, il a été montré que celle-ci était constituée d'au moins trois protéines : HydE, HydG et HydF. Indépendamment et à la même époque notre laboratoire isolait les deux premières protéines, en particulier parce qu'elles appartiennent à une famille de protéines fer-soufre, dite « Radical-SAM », que le laboratoire étudie depuis de nombreuses années (ribonucléotide réductase, spore photoproduct lyase, MiaB, biotine synthase,….). Plus récemment, nous avons isolé la protéine HydF, une protéine fer-soufre originale présentant une activité GTPase.

Les objectifs de ce sujet de recherche sont :

  • une compréhension fondamentale des mécanismes moléculaires de la maturation des hydrogénases (études structurales et fonctionnelles des enzymes HydE, HydF et HydG).
  • l'expression hétérologue d'hydrogénases permettant de produire des organismes plus efficaces dans la production de l'hydrogène.
  • La conception de catalyseurs bio-mimétiques efficaces sera facilitée par une compréhension détaillée des structures et mécanismes réactionnels mis en oeuvre dans les enzymes. Pour la synthèse de tels catalyseurs il pourrait être judicieux de s'inspirer des réactions ayant lieu in vivo, c'est à dire catalysées par les protéines impliquées dans l'assemblage des sites actifs.
 
Réparation de l’ADN par la Spore Photoproduct Lyase
 
Les spores bactériennes (B. subtilis) sont particulièrement résistantes à toutes sortes de stress. Sous irradiation UV leur ADN est sélectivement modifié par production de dimères de thymine appelés spore photoproduits (SP) et ces bactéries possèdent un système de réparation très efficace, la spore photoproduit lyase (SPL), qui régénère les thymines (Figure ci-contre : Formation et réparation de dimères de thymine). SPL est une enzyme fer-soufre de la famille « Radical-SAM », que nous avons récemment purifiée. Nous nous proposons de mieux la caractériser en particulier du point de vue de sa réactivité, de sa spécificité de substrats (dimères vs oligonucléotides, stéréosélectivité,…) et du point de vue de sa structure (collaboration avec Y Nicolet, IBS) en complexe ou non avec ses substrats. Cela passe en particulier par la synthèse des différents isomères de SP, incorporés ou non dans des oligonucléotides, ainsi que la synthèse d'inhibiteurs (analogues de substrats) (collaboration avec T Douki, CEA Grenoble). Ce projet devrait conduire à la mise en évidence de mécanismes originaux de réparation de l'ADN ainsi qu'à la découverte de molécules anti-SPL à potentialités antibactériennes (collaboration Sandrine Ollagnier-de Choudens).
 
Modification des ARN de transferts
 
Les ARN de transfert (ARNt) sont de petites molécules constituées de 75 à 101 nucléotides qui jouent le rôle d'adaptateurs dans le processus de traduction génétique. Une des caractéristiques des ARNt est qu'ils ne contiennent pas seuleument les quatre nucléosides canoniques. En plus de l'adénosine, de la guanosine, de la cytidine et de l'uridine, les ARNt contiennent un grand nombre de nucléosides modifiés. Dans la très grande majorité des cas, la biosynthèse de ces nucléosides modifiés est post-transcriptionnelle. Le profil de modification de chaque ARNt varie en fonction de sa séquence nucléotidique mais également en fonction de l'organisme dont il est issu et même de sa localisation dans les differents organites cellulaires. Ce projet s'inscrit dans la thématique plus générale de la biosynthèse de molécules soufrées et la formation de liaisons C-S (voir Dr. Étienne Mulliez).
 
Thèses soutenues
 
Simon Arragain.
Insertion de soufre en biologie par voie radicalaire. Étude des méthylthiotransférases.
[Résumé] [Thèse en ligne]

Fabien Pierrel.
Modification des ARNt par une protéine «Radical-SAM». Étude de la protéine MiaB.
[Résumé]

Alexia Chandor-Proust.
Réparation de l'ADN par une protéine "Radical-SAM" : Étude de la Spore Photoproduct Lyase.
[Résumé] [Thèse en ligne]
 
Sélection de publications
 

Wei FY, Suzuki T, Watanabe S, Kimura S, Kaitsuka T, Fujimura A, Matsui H, Atta M, Michiue H, Fontecave M, Yamagata K, Suzuki T and Tomizawa K
Deficit of tRNA(Lys) modification by Cdkal1 causes the development of type 2 diabetes in mice.
Journal of Clinical Investigation, 2011, 121(9): 3598-3608

  

Arragain S, Garcia-Serres R, Blondin G, Douki T, Clemancey M, Latour JM, Forouhar F, Neely H, Montelione GT, Hunt JF, Mulliez E, Fontecave M and Atta M
Post-translational modification of ribosomal proteins: Structural and functional characterization of RimO from Thermotoga maritima, a radical-SAM methylthiotransferase.
Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(8): 5792-5801

Arragain S, Handelman SK, Forouhar F, Wei FY, Tomizawa K, Hunt JF, Douki T, Fontecave M, Mulliez E and Atta M
Identification of eukaryotic and prokaryotic methythiotransferases for biosynthesis of 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine in tRNA.
Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(37): 28425-28433

Atta M, Mulliez E, Arragain S, Forouhar F, Hunt JF and Fontecave M
S-Adenosylmethionine-dependent radical-based modification of biological macromolecules.
Current Opinion in Structural Biology, 2010, 20(6): 684-692

Chandor-Proust A, Berteau O, Douki T, Gasparutto D, Ollagnier de Choudens S, Fontecave M and Atta M
DNA repair and free radicals: New insights into the mechanism of spore photoproduct lyase revealed by single amino acid substitution.
Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(52): 36361-36368

Fontecave M, Mulliez E and Atta M
New light on methylthiolation reactions.
Chemistry and Biology, 2008, 15(3): 209-210

Chandor A, Douki T, Gasparutto D, Gambarelli S, Sanakis Y, Nicolet Y, Ollagnier-De-Choudens S, Atta M and Fontecave M
Characterization of the DNA repair spore photoproduct lyase enzyme from Clostridium acetobutylicum: A radical-SAM enzyme.
Comptes Rendus Chimie, 2007, 10(8): 756-765

Hernandez HL, Pierrel F, Elleingand E, Garcia-Serres R, Huynh BH, Johnson MK, Fontecave M and Atta M
MiaB, a bifunctional radical-S-adenosylmethionine enzyme involved in the thiolation and methylation of tRNA, contains two essential [4Fe-4S] clusters.
Biochemistry, 2007, 46(17): 5140-5147

Mathevon C, Pierrel F, Oddou JL, Garcia-Serres R, Blondin G, Latour JM, Menage S, Gambarelli S, Fontecave M and Atta M
tRNA-modifying MiaE protein from Salmonella typhimurium is a nonheme diiron monooxygenase.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2007, 104(33): 13295-13300

Brazzolotto X, Rubach JK, Gaillard J, Gambarelli S, Atta M and Fontecave M
The [Fe-Fe]-hydrogenase maturation protein HydF from Thermotoga maritima is a GTPase with an iron-sulfur cluster.
Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(2): 769-774

Chandor A, Berteau O, Douki T, Gasparutto D, Sanakis Y, Ollagnier-de Choudens S, Atta M and Fontecave M
Dinucleotide spore photoproduct, a minimal substrate of the DNA repair spore photoproduct lyase enzyme from Bacillus subtilis.
Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(37): 26922-26931

Friedel M, Berteau O, Pieck J, Atta M, Ollagnier-de Choudens S, Fontecave M and Carell T
The spore photoproduct lyase repairs the 5S- and not the 5R-configured spore photoproduct DNA lesion.
Chemical Communications (Camb), 2006, 28: 445-447

Rubach JK, Brazzolotto X, Gaillard J and Fontecave M
Biochemical characterization of the HydE and HydG iron-only hydrogenase maturation enzymes from Thermatoga maritima.
FEBS Letters, 2005, 579(22): 5055-5060

Pierrel F, Douki T, Fontecave M and Atta M
MiaB protein is a bifunctional Radical-S-adenosylmethionine enzyme involved in thiolation and methylation of tRNA.
Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(46): 47555-47563

Pierrel F, Hernandez HL, Johnson MK, Fontecave M and Atta M
MiaB protein from Thermotoga maritima: Characterization of an extremely thermophilic tRNA-Methylthiotransferase.
Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(32): 29515-29524

Pierrel F, Björk GR, Fontecave M and Atta M
Enzymatic Modification of tRNAs: MiaB is an iron-sulfur protein.
Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(16): 13367-13370