Direction des sciences du vivant

Les ATPases de type P1 assurent le transport, à travers une membrane, des ions métalliques lourds contre leur gradient électrochimique, en utilisant l'énergie libérée dors de l'hydrolyse de l'ATP.
L'objectif de cette thèse réside dans l'étude fonctionnelle de CadA_LM, ATPase de type P1 engagée dans la détoxication du cadmium chez Listeria monocytogenes.
Ce travail a débuté par l'expression hétérologue de l'ATPase CadA_LM dans les cellules SF9 via Baculovirus. L'étude de CadA_LM a permis de révéler ses caractéristiques enzymatiques principales démontrant un mécanisme enzymatique analogue à celui des ATPases de type P2, les ATPases les plus étudiées de la famille des ATPases de type P. Ce travail a aussi contribué à une délimitation de la spécificité ionique de CadA_LM, confirmant son appartenance à la sous-famille des ATPases de type P1 impliquées dans le transport du cadmium, du zinc ou du plomb. L'étude d'une protéine CadA_LM tronquée de son domaine cytoplasmique N-terminal de liaison des ions métalliques lourds - la caractéristique structurale majeure des ATPases de type P1 - a attesté que ce domaine n'était pas essentiel au fonctionnement de l'ATPase. Néanmoins, un rôle régulateur dans l'activation de CadA_LM par les métaux lui a été attribué. Enfin, l'étude du rôle du motif CPC de CadA_LM, situé dans la sixième hélice transmembranaire et hautement conservé parmi les ATPases de transport des métaux lourds, a suggéré son implication dans le(s) site(s) de transport membranaire. En marge de ces résultats sur la caractérisation biochimique de la protéine CadA_LM, un nouveau phénotype associé à l'expression de CadA_LM a été découvert dans la levure Saccharomyces cerevesiae. Ce phénotype s'est révélé utilisable en tant que système de criblage pour l'identification de mutants non fonctionnels, et donc pour la détermination d'acides aminés essentiels au fonctionnement de l'ATPase.

P1-type ATPases are membrane proteins responsible for the active transport of heavy metal ions against their electrochemical gradient, across the membrane. This is achieved by using the energy of hydrolysis of ATP.
The goal of this thesis was to elucidate the functional properties of CadA_LM, a P1-type ATPase involved in Listeria monocytogenes resistance to cadmium.
Our research began with the expression of CadA_LM in Sf9 cells using a Baculovirus mediated system. The study of CadA_LM allowed us to determine its main enzymatic characteristics, revealing a mechanism similar to those of the P2-type ATPases, the most well-known ATPases of the P-type family. This work also clarified the ionic specificity of CadA_LM, confirming that this ATPase can be classified with the sub-group of P1-type ATPases that translocate cadmium, zinc or lead. By studying a modified CadA_LM truncated of its cytoplasmic N-terminal metal-binding domain - the main strutural characteristic of the P1-type ATPases - we concluded that this domain is not essential for CadA_LM function. Nevertheless, a regulatory role of the activation of CadA_LM by metal ions has been assigned to this domain. Lastly, the study of the CPC motif, another distinguishing feature of heavy metal transport ATPases which is located in the sixth transmembrane helix, revealed that this motif can be part of the membranous transport site(s). Beside this biochemical characterisation of CadA_LM, a new phenotype of the yeast Saccharomyces cerevisiae was discovered when expressing CadA_LM. This phenotype was used as a screenig system to select non-functional mutants. It can therefore be used to determine the essential amino acids for CadA_LM functioning, helping to understand the structure-function relationships of the ATPase.