Direction des sciences du vivant

Ce travail vise à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans la régulation des canaux potassiques sensibles à l'ATP (canaux K_ATP) et à évaluer les homologies fonctionnelles entre une des sous-unités de ce canal et des protéines homologues, impliquées dans la résistance aux anti-cancéreux ou dans la mucoviscidose. Les canaux K_ATP sont composés de deux sous-unités s'assemblant en un complexe octamérique : Kir6.2 forme le pore du canal, inhibé par l'ATP intracellulaire, et SUR, appartenant à la famille des protéines ABC (ATP-Binding-Cassette), est la sous-unité régulatrice du canal, responsable de la sensibilité aux sulfonylurées et aux ouvreurs potassiques.
Nous avons étudié les relations entre les nucléotides intracellulaires et les ouvreurs potassiques et mis en évidence la capacité d'un ouvreur, le diazoxide, à activer les canaux K_ATP cardiaques SURA/Kir6.2 en synergie avec l'ADP intracellulaire. De plus, nous nous sommes intéressés à l'effet des ions Zn²⁺ sur les canaux K_ATP et avons mis en évidence un puissant rôle activateur via un ou plusieurs sites accessibles des deux faces de la membrane.
Puisque SUR présente de fortes homologies de séquence (environ 30 % d'identité) avec d'autres protéines ABC de la sous-famille MRP ou ABCC, nous avons utilisé différentes approches pour découvrir d'éventuelles homologies fonctionnelles entre ces protéines. Ainsi, nous avons mis en évidence une activité inhibitrice de composés activateurs de CFTR, développés par l'équipe de F. Becq sur les canaux K_ATP. Nous avons d'autre part testé la capacité

de protéines homologues à SUR à se substituer à SUR pour former des canaux K_ATP ; dans cette optique, nous avons construit des protéines fusion pour forcer Kir6.2 à s'associer avec d'autres protéines que SUR. Nos résultats montrent que l'association MRP1-Kir6.2 permet la formation de canaux fonctionnels dont l'activité peut-être étudiée par la technique du patch-clamp, tandis que l'association YCF1-Kir6.2 ne forme pas de canaux fonctionnels dans la membrane plasmique. La spécificité de MRP1 repose donc sur sa capacité à masquer les signaux de rétention de Kir6.2. Ces permières données apportent des informations sur les mécanismes contrôlant le transport des canaux K_ATP à la membrane. La poursuite de ce travail s'orientera vers l'étude des propriétés pharmacologiques de ces protéines.

This work aims at studying the regulation of ATP-sensitive potassium channels (K_ATP) and at investigating homologies of one subunit with homologous proteins involved in cystic fibrosis or resistance to anti-cancer grugs. K_ATP channels play important role in many cellular functions by coupling the cell metabolism to electrical activity. They comprise two distinct subunits that assemble in a octomeric complex: an inwardly restifying K⁺ channel (Kir6.2) and an ATP binding cassette (ABC) protein, the sulfonylurea receptor SUR. Four Kir6.2 subunits form a pore inhibited by ATP, whereas SUR proteins act as peripheral regulators and confer sensitivity to sulfonylureas and potassium channel openers.
We investigated the interactions between intracellular nucleotides and diazoxide, an opener known to specifically activate pancreatic SUR1/Kir6.2 channels. Our results show that this compound also activates cardiac SUR2A/Kir6.2 K_ATP channels in the presence of 10 to 100 µM MgADP. We also investigated the effect of Zn²⁺ on K_ATP channels and demonstrate that this metal is a potent activator of these channels.
As SUR shares approximately 30 % amino acid identity with others members of the MRP (ABCC) subfamily of ABC proteins (CFTR, MRP, YCF1…), we further studied functional homologies between these proteins. In collaboration with the laboratory of F. Becq we tested the effect of MPB compounds, designed to activate CFTR, on K_ATP channels. In order to test if other ABC proteins could substitute for SUR in forming K_ATP channels, we generated fusion proteins to force Kir6.2 to associate with non-SUR proteins. Data show that the fusion of MRP1 and Kir6.2 (MRP1-Kir6.2) is correctly addressed to the plasma membrane and form ATP-sensitive potassium channels in Xenopus oocytes that can be studied with the patch-clamp technique, but that the fusion of YCF1 and Kir6.2 (YCF1-Kir6.2) does not form functional channels. These first results give unexpected information about how K_ATP channels are addressed to the membrane. Further experiments will be carried out to study pharmacological properties of these proteins.