Direction des sciences du vivant

Les flavines NAD(P)H oxydoréductases ou flavine réductases sont des enzymes ubiquitaires. Elles catalysent la réduction des flavines libres (FMN, FAD ou riboflavine) en utilisant le NAD(P)H comme donneurs d’électrons. Les flavines réductases sont donc des enzymes qui utilisent la flavine comme substrat et non comme cofacteur. Cependant le rôle physiologique de ces protéines est mal défini. Très récemment, il a été montré que des flavine réductases sont impliquées dans des réaction d’hydroxylation en agissant de concert avec une mono-oxygénase.
Nous nous sommes intéressés dans une première partie de ce travail à la flavine réductase Fre d’E.coli. Le séquençage du génome de cette bactérie laissait penser que Fre pouvait être impliquée dans la biosynthèse de l’ubiquinone au niveau de l’étape d’hydroxylation du 2-octaprénylphénol. Différentes expériences nous ont permis de conclure que Fre ne joue aucun rôle dans la biosynthèse de l’ubiquinone. Cependant, Fre pourrait être en relation avec la chaîne respiratoire. Dans une deuxième partie de ce travail, nous étudions une flavine réductase de Streptomyces coelicolor ActVB qui joue un rôle dans la biosynthèse d’un antibiotique l’actinorhodine. ActVB intervient dans la dernière étape de cette biosynthèse au niveau d’une réaction d’hydroxylation. Nous avons surproduit et purifié ActAB. La protéine purifiée est associée a du FMN. Ce FMN peut être réduit par du NADH, signifiant qu’il est placé de façon optimale au site actif de l’enzyme. Cependant, nous avons montré que la présence ou non de ce cofacteur FMN n’influence aucunement l’activité flavine réductase d’ActVB. ActVB possède un mécanisme enzymatique séquentiel ordonné. Le NADH est le premier substrat à se fixer et la flavine réduite le dernier produit à être libéré. La reconnaissance de la flavine par l’enzyme s’effectue principalement par cycle isoalloxazine. La chaîne carbonée et plus particulièrement la position 2'-OH joue un rôle non négligeable. La reconnaissance du NADH nécessite une molécule intègre, aucune affinité marquée n’est mis en évidence pour une des parties de la molécule de NADH.
ActVB comme toutes les flavine réductases possède une activité de réduction du fer ferrique en présence de flavines libres et d'un donneur d’électrons NAD(P)H. ActVB est également capable de réduire les complexes de fer sans la présence de flavine libre. Nous avons montré que cette fois, à la différence de l’activité flavine réductase, c’est le cofacteur FMN qui est responsable de cette activité. Nous montrons d’ailleurs que cette réduction du fer ferrique s’effectue suivant un mécanisme enzymatique de type Ping-Pong. ActVB dont le comportement est dual vis-à-vis de la flavine, soit substrat soit cofacteur, illustre bien que le lien structural et/ou évolutif entre les flavine réductases et les flavoprotéines est fort.
Dans la biosynthèse de l’actinorhodine, ActVB est associée a une mono-oxygénase. Nous avons identifié le produit du gène ActVA-ORF5 comme étant cette mono-oxygénase. Nous avons cloné ce gène et purifié la protéine qui en résulte. Nous rapportons également la mise en évidence de l’hydroxylation de la 1,5 dihydroxyanthraquinone par ActVA-ORF5. Cette réaction nécessite la présence d’ActVB et de ses substrats (NADH et FMN) ainsi que de l’oxygène.


NAD(P)H:flavin oxidoreductase are ubiquitous enzyme. They catalyse the reduction of free flavins (riboflavin, FAD, FMN) by reduced pyridine nucleotides NAD(P)H as electron donor. Flavin reductase use flavin as substrate and not as cofactor. The real biological function of flavin reductase is still not well understood. Recently, a group of flavin reductase has been associated with hydroxylation reaction in combination with flavin dependent monooxygenase.
In a first part, we have worked on the Fre enzyme found in E. coli. The sequencing of E. coli genome reveals that Fre can play a role in ubiquinone biosynthesis in the hydroxylation of 2-octaprenylphenol. The experiments revealed that Fre is not implicated in ubiquinone biosynthesis, but that it could play a role in respiratory chain.
In a second part of this work, we have studied ActVB, a flavin reductase from Streptomyces coelicolor. ActVB is a NADH:flavin oxidoreducatse participating in the last step of actinorhodine biosynthesis. We have overexpressed and purified ActVB. The preparation of ActVB had highly varible amount of protein bound FMN. However, flavin reductase activities (FAD, FMN, riboflavin) do not depend on the amount of FMN bound to the protein. Act VB proceeds by an ordered sequential mechanism, where NADH is the first substrate and reduced flavin the last product. We have showed that both ribitol-phosphate chain and the isoalloxazine ring contribute to the protein flavin interaction.
ActVB, like other flavin reductase, can reduce the ferric iron in presence of NADH and free flavin. Here, we showed that ActVB can reduce ferric iron in the absence of free flavin because of the presence of FMN bound to the protein. The reduction of ferric iron by ActVB proceeds through a Ping-Pong mechanism.
We have identified the monooxygenase that is associated to ActVB in actinorhodine biosynthesis. ActVA-ORF5 was cloned and overexpressed in E. coli cell. We have established ActVA-ORF5 purification procedure. Finally, we found that the hydroxylation of 1,5 dihydroxyanthraquinone can occur only in presence of ActVB, FMN, NADH and oxygen.