Caractérisation des protéines de régulation impliquées dans la résistance au mercure inorganique chez Ralstonia metallidurans CH34.
Characterization of regulatory proteins involved in the inorganic mercury resistance in Ralstonia metallidurans CH34.
De nombreux aspects de la résistance bactérienne au mercure ont été étudiés depuis une trentaine d'années chez divers micro-organismes. Les données biochimiques sont encore disparates et certaines sont manquantes pour parfaitement définir un modèle global de la résistance à ce métal lourd. Le but de cette étude était donc de contribuer à l'élaboration d'un tel modèle chez un seul et même organisme. Il a donc été décidé d'étudier en particulier l'opéron mer porté par le transposon Tn4378, issu du plasmide pMol28 de Ralstonia metallidurans CH34. Pour plus de facilité dans les études menées au laboratoire, il a été transposé chez Escherichia coli et son expression en présence de mercure a été caractérisée chez cette bactérie. E. coli exprimant l’opéron mer de R. metallidurans CH34 devient effectivement pleinement résistante au mercure. Cet opéron mer canonique comporte cinq gènes codant pour les protéines suivantes : MerR est un régulateur, MerP et MerT interviennent dans le transport, MerA permet la réduction de l'ion mercurique en mercure métallique, beaucoup moins toxique et enfin le rôle de MerD est supposé être celui d’un co-régulateur. Une deuxième partie de ce travail a donc concernée l'étude de MerA avec notamment une caractérisation spectroscopique des propriétés redox de son site actif, ainsi qu'une identification de son co-facteur flavinique. Les résultats montrent que MerA de Tn4378 est analogue aux autres MerA déjà connues. Pour la première fois chez ce type de protéine, l'existence d'un fragment de protéolyse N-terminal a été démontrée. Enfin, un effort particulier a porté sur l'étude de la régulation de cet opéron mer. Comme l’activité de MerD est indissociable de celle de MerR, cette dernière a été caractérisée dans un premier temps par des essais de mobilité sur gel et d'empreinte de protection à la DNase I. MerD est incapable de se lier à la séquence d’ADN reconnue par MerR. Par contre, elle participe à un complexe ternaire ADN-MerR-MerD. La formation et la stabilité de ce complexe ternaire sont dépendantes de la concentration relative des deux protéines et de la concentration en mercure. Le rôle qui a été attribué à MerD à la suite de cette étude est de déplacer le complexe MerR-Hg du site de régulation de l’opéron pour permettre son remplacement par MerR non métallée. Ceci a pour effet de stopper l’expression de l’opéron mer quand le stress mercure disparaît. MerD est donc un co-régulateur négatif.
Many aspects of the bacterial mercury resistance have been studied since thirty years. Biochemical data was obtained from different microorganisms and some points are misunderstood. Then, it is difficult to clearly define a global model of mercury resistance. The aim of this study was to contribute to elaborate a model in one bacterium. For this purpose, the mer operon of the Tn4378 transposon, carried on the pMol28 plasmid of Ralstonia metallidurans CH34, was studied. To make the work easier, the latter mer operon was transposed in Escherichia coli and its expression was characterized in the presence of mercury. This modified bacterium expresses the mer operon and becomes fully resistant to mercury. The mer operon contains five genes encoding for the following proteins: MerR is a regulator, MerP and MerT are transport proteins, MerA allows the reduction of Hg(II) to Hg(0), a less toxic form and MerD is supposed to be a co-regulator. The second part of this work deals with the purification and the characterization of MerA of Tn4378. The redox properties of the active site and the co-factor identification show that MerA from Tn4378 is very similar to the well-understood ones. For the first time, the existence of a proteolysis fragment was identified. As the role of MerD is supposed to be strongly related to the presence of MerR, DNA-MerR interactions were first characterized by gel shift mobility assays and DNase I footprint. Using the same techniques, MerD did not bind the operator-promoter sequence recognized by MerR. However, MerD is involved in a DNA-MerR-MerD ternary complex. The formation and the stability of this complex depend on the relative concentrations of each protein and on the mercury concentration. As a conclusion the MerD role is to displace the MerR-Hg complex from the operator-promoter sequence. This allows the binding of DNA by non-metalled MerR. Thus, the mer operon expression is repressed when mercury decreses. MerD is a negative co-regulator.
Soutenue le 14 novembre 2003 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie
