CEA Direction des sciences du vivant - iRTSV : Philippe Simon

Philippe Simon

Philippe Simon	Résumé / Summary
Nouveaux outils pour la coupure et la détection d'ADN	Ce travail porte sur la synthèse et l'étude des propriétés de nouveaux dérivés flaviniques, constitués par un dérivé de flavine conjugué à une chaîne de type nucléotidique ou nucléopeptidique (PNA). Un des objectifs de ce travail était de déterminer si la flavine peut jouer le rôle de marqueur rédox témoin de l'hybridation antre les conjugués oligonucléotide-flavine et leurs complémentaires. Les résultats ont montré que les potentiels rédox des flavines sont modifiées en présence d'un ADN cible. Ceci est probablement dû au nouvel environnement électronique créé autour du noyau isoalloxazine, ce qui se traduit par une modification des propriétés rédox de celui-ci. Les résultats de cette étude ont permis de démontrer que, grâce à la modification du potentiel rédox de la flavine en présence d'un brain d'ADN cible, les conjugués oligonucléotide-flavine peuvent être utilisés pour la détection électrochimique d'un ADN complémentaire dans un échantillon. Notre travail a aussi permis de montrer que les conjugués oligonucléotide-flavine sont à la base d'un nouveau système de détection d'ADN avec amplification du signal. Ce système fait intervenir la flavine réductase d'Escherichia coli pour la mise en évidence de l'hybridation, cette enzyme étant capable de différencier des conjugués oligonucléotide-flavine hybridés ou non. L'amplification du signal est quant à elle assurée par le cycle catalytique d'oxydation/réduction de la flavine. Les expériences effectuées ont montré qu'il est possible de détecter environ une picomole d'ADN cible dans un échantillon avec ce système. Afin d'obtenir une sensibilité plus importante, un autre système faisant intervenir un conjugué oligonucléotide inhibiteur est actuellement en cours d'étude. L'autre objectif de notre travail était la synthèse d'une nucléase artificielle faisant intervenir une enzyme et un conjugué oligonucléotide-flavine afin d'induire des coupures sur un ADN cible, comme par exemple un ADN viral. En effet, la flavine, une fois réduite par la flavine réductase d'Escherichia coli, produit des espèces activées de l'oxygène toxiques pour la cellule capables de dégrader un acide nucléique. La synthèse et l'étude d'un PNA-flavine en coupure d'ADN a montré que ce système est capable de recruter une enzyme présente dans le milieu intracellulaire afin d'induire des lésions spécifiques sur un ADN complémentaire in vitro.
Soutenue le 26 novembre 2004 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Chimie
Jury : Rapporteur : Dr. Jean-François Mouscadet Rapporteur : Dr. Jean-Jacques Vasseur Examinateur : Dr. Didier Gasparutto Directeur de thèse : Pr. Jean-Luc Decout Directeur de thèse : Pr. Marc Fontecave
Mots-clés :	Flavine, nucléase artificielle, PNA, détection d'ADN, flavine réductase
Keywords:	Flavin, artificial nuclease, PNA, DNA detection, flavin reductase