Direction des sciences du vivant

Les ATPases de type P1 assurent le transport d'ions métalliques lourds tels que le Cu⁺, le Cd²⁺ ou le Zn²⁺ à travers une membrane. Ce transport, qualifié d'actif parce que s'exerçant en sens inverse du gradient électrochimique de l'ion transporté, utilise l'énergie libérée lors de l'hydrolyse de l'ATP. Une étude accomplie en 1992 indique que 36% des Listeria monocytogenes sont résistantes à de hautes concentrations de Cd²⁺. Cette résistance est associée à la présence de plasmides, parmi lesquels pLm74 qui présente une séquence de 2136 paires de bases codant pour un polypeptide de 711 acides aminés nommé CadA. Ce polypeptide possède les 3 séquences signatures des ATPases de type P, les motifs DKTGT, MxTGD et TGDGxNDxP et les 2 séquences signatures des ATPases de type P1, les motifs CXXC et CPC. L'objectif de cette thèse était la recherche des acides aminés constituant la voie de passage du Cd²⁺ au sein du domaine transmembranaire de CadA. Ce travail a nécessité l'expression de CadA dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la caractérisation du phénotype de sensibilité au Cd²⁺ induit par la présence de CadA. Il a aussi nécessité une étude enzymatique de CadA au cours de laquelle nous avons montré que le Cd-ATP pouvait remplacer le Mg-ATP dans le cycle enzymatique de la protéine. Quatre hélices transmembranaires (3, 4, 6 et 8) constitueraient la voie de passage du Cd²⁺ dans CadA. Au sein de ces hélices, les acides aminés M149, C354 et T684 pourraient faire partie du site de liaison tandis que E164 et C356 pourraient être importants dans le processus de dissociation du métal. P355 et D692 seraient nécessaires à la phosphorylation de l'enzyme.
L'étude des domaines cytoplasmiques N (liaison des nucléotides) et P (phosphorylation) de CadA a été aussi abordée au cours de cette thèse. La caractérisation fonctionnelle d'ATPases chimériques a mis en évidence la possibilité d'échanger le domaine de phosphorylation entre différentes ATPases de type P.







P1-type ATPases transport heavy metals across the membrane against their electrochemical gradient using the hydrolysis of ATP as energy source. In 1992, a study reported that 36% of Listeria monocytogenes were resistant to high Cd²⁺ concentrations. This resistance was associated to the presence of plasmids, among which pLm74 presents an open reading frame coding for a polypeptide of 711 amino acids, named CadA. This polypeptide possesses 3 consensus sequences of P-type ATPases, the DKTGT, MXTGD and TGDGXNDXP motifs, as well as 2 consensus sequences of P1-type ATPases, the CXXC and CPC motifs. In the present work we expressed CadA in the yeast Saccharomyces cerevisae and used the phenotype of sensitivity to cadmium induced by CadA as a screening tool for mutants produced by site-directed mutagenesis. We also demonstrated that CadA can use Cd-ATP instead of Mg-ATP as ATP substrate to accomplish its enzymatic cycle. Four transmembrane helices (3, 4, 6 and 8) might constitute the Cd²⁺ transport site of CadA. Among them M149, C354 and T684 might participate in transport sites whereas E164 and C356 could be important in the dissociation process of cadmium. P355 and D692 could be necessary for the phosphorylation. Finally, the study of chimeric ATPases suggests a regulatory role of the ATP binding domain.