Direction des sciences du vivant

L’objectif de cette thèse réside dans l’étude du convoyage du Cu(I) à l’intérieur de l’appareil de Golgi dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La métallo-chaperonne Atx1 séquestre le Cu(I) cytosolique puis le transfère à l’extrémité N-terminale de l’ATPase Ccc2, localisée dans les membranes du Golgi. Ce domaine N-terminal est constitué de deux domaines de liaison aux métaux lourds, dénommés M1 et M2, qui sont homologues à Atx1.
Des tests de complémentation dans une souche ΔATX1 ont montré que des protéines analogues à Atx1, de par un repliement ßαßßαß et la présence d’un motif de liaison aux métaux lourds CxxC (M1 et M2 produits en protéines solubles par exemple) pouvaient se substituer à Atx1. Afin d’améliorer la sensibilité du test phénotypique, un nouveau vecteur d’expression a été créé qui permet l’expression de Ccc2 en infime quantité.
En utilisant ce nouveau système d’expression, des tests de complémentation ont été réalisés dans une souche ΔATX1ΔCCC2. La co-expression d’Atx1 (ou d’un homologue) avec des protéines Ccc2 modifiées sur leur extrémité N-terminale a permis de caractériser in vivo le mécanisme de transfert du Cu(I) entre les deux protéines partenaires. Ainsi, Atx1 et certains homologues délivrent le Cu(I) indifféremment à M1 ou à M2 de Ccc2. Néanmoins, les homologues sont moins efficaces qu’Atx1. Cette différence de fonctionnalité semble dépendre de la flexibilité de la boucle de liaison au métal des homologues, ainsi que de leurs surfaces de potentiel électrostatique. Le cuivre lié sur l’extrémité N-terminale de l’ATPase est ensuite transféré à un site de liaison qui reste à définir, localisé potentiellement sur la grande boucle cytoplasmique de Ccc2.

The main goal of my PhD is to investigate in yeast how copper is transferred from the cytosolic metallochaperone Atx1 to Ccc2, the ATPase embedded in the Golgi membranes that is responsible for copper delivery to the secretory pathway. An interaction was previously shown between Atx1 and Ccc2 N-terminus which encloses two Atx1-like domains, denoted M1 and M2. To study copper transfer, complementation assays were performed in an atx1-Δ yeast strain: several structural homologues (such as M1 and M2 produced as soluble proteins) could replace Atx1 in delivering copper to Ccc2. To increase the sensitivity of these phenotypic tests, a yeast expression vector was engineered to produce hardly detectable amounts of Ccc2. Using this new system of expression, we co-expressed, in an atx1-Δ ccc2-Δ yeast strain, Atx1 (or an homologue) and a modified Ccc2 bearing a mutated or truncated N-terminus. Such complementation assays were analyzed to assess copper transfer to either M1 or M2 tethered to Ccc2. Atx1 and some homologues transfer copper either to M1 or to M2 tethered to Ccc2. Complementation was less efficient with homologues than with Atx1, enhancing the special properties of Atx1. Once on the N-terminus, copper is thought to be delivered to another copper binding site of the protein, potentially localised on the large cytosolic loop of Ccc2.