Direction des sciences du vivant

Un polypeptide néosynthétisé est capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tri-dimensionnelle finale, en passant par des intermédiaires partiellement structurés. L’acquisition d’information sur le rôle et l’importance de ces intermédiaires est rendue difficile parce qu’ils se forment très rapidement pendant la réaction de repliement et que cette période de temps n’est pas accessible aux appareils de mélange usuels.
L’objet de cette thèse était de caractériser les évènements cinétiques initiaux du repliement des protéines, notamment de l’apomyoglobine (apoMb), en utilisant des appareils de mélange ultra-rapide. Un appareil de type stopped-flow équipé d’une micro-cuve a permis de diminuer le temps mort de ce type de mélangeur. Une réaction bimoléculaire (NATA et NBS), à permis d’évaluer le temps mort à 400±10 µs, dans un mode d’utilisation permettant de suivre simultanément le signal de fluorescence et le signal de dichroïsme circulaire dans l’UV lointain. L’apoMb est une protéine particulièrement intéressante pour l’étude des évènements précoces du repliement des protéines. Le stopped-flow ultra rapide, a permis de suivre des cinétiques (k jusqu’à 1500 s^-1) et montré que chaque étape précédemment identifiée, conduisant l’apoMb de sa forme dépliée à sa forme native (soit les réactions UI_a, I_aI_b, et I_bN), présente les caractéristiques typiques d’une réaction à deux états, hautement coopérative.
Nous avons étudié l’effet d’osmolytes sur les cinétiques et sur la stabilité à l’équilibre des formes U, I et N de l’apoMb. Des études cinétiques en présence de sucrose ont permis d’observer le comportement de la réactions UI_a. Ces résultats indiquent que le sucrose déstabilise de manière relative la forme U et l’état de transition de la réaction UI_a, par rapport à la forme Ia. L’étape limitante ne correspondrait donc pas à une compaction de la chaîne peptidique. Dans les mêmes conditions, l’étude de la transition I_bN permet d’observer que l’état de transition présente des caractéristiques proches de I_b. Ces résultats, décrivant l’effet osmophobique sur l’intermédiaire I, ainsi que des résultats préliminaires de l’effet d’encombrement moléculaire sur le repliement du cytochrome C, sont discutés dans ce mémoire.

A neo-synthesized polypeptide is able to found its specific pathway upon several accessible ways to its final three-dimensional structure by passing trough partially structured intermediate in a very short time. Collecting data in order to improve our knowledge on this intermediate is crucial, but it’s necessary to improve mixing apparatus to be able to record the protein fast events of folding.
The purpose of these thesis was to follow fast protein folding events, in particular apomyoglobin (apoMb), by using ultra fast mixing apparatus. A stopped-flow apparatus with a customized micro-cuve, decreases the mixing time. A bimolecular reaction (Nata & NBS) was used to determine a 400±10 µs dead time, in fluorescence and far UV circular dichroïsm modes. ApoMb is a particularly interesting protein for the study of early protein folding events. The ultra-fast stopped-flow allowed us to follow rapid kinetics (k up to 1500 s^-1). The data show that each previously identified steps leading unfolded apoMb to its native conformation, namely the UI_a, the I_aI_b and the I_bN reactions, exhibits a two-state highly cooperative behaviour.
We studied the effects of osmolytes on the kinetics and on the equilibrium stability of U, I and N forms of apoMb. Fast kinetic studies in the presence of sucrose, allow to show the behaviour of the UI_a reaction. These results show that sucrose destabilizes, the U form and the transition state of the UI_a reaction relative to the I_a form. The rate limiting step appears to precede compaction of the peptidic chain. In the same conditions the I_bN transition shows transition state characteristics close to those of the I_b state. These results, showing the osmophobic effect on the I intermediate, and also preliminary studies about molecular crowding on cytochrom C, are discussed in these manuscript.