Direction des sciences du vivant

Le transporteur ADP/ATP appartient à une famille de protéines (Mitochondrial Carrier Family, MCF) comptant plusieurs dizaines de membres aux caractéristiques communes (masse molaire, structure tripliquée, présence d'une séquence peptidique commune...) mais très sélectifs en regard des espèces transportées.
La découverte et l'étude approfondie de la protéine responsable du transport ADP/ATP des mitochondries sont liées à l'existence de deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) d'origine végétale et l'acide bongkrékique (BA) produit par une bactérie. En particulier, CATR et BA figent le transporteur dans des conformations distinctes, stables, représentant vraisemblablement des états extrêmes que le transporteur adopte au cours du processus de transport (Figure 1).


Figure 1 : La transition du transporteur entre états conformationnels distincts, accélérée par l'ADP ou l'ATP, intervient lors du transport. Les inhibiteurs CATR et BA interdisent cette transition en immobilisant le transporteur sous la forme de complexes stables.

Par protéolyse ménagée, nous avons montré que le transporteur était clivé au niveau de la région centrale. L'isolement et l'identification, par immunoréactivité puis par séquençage, des fragments produits a conduit à deux conclusions principales : 1/ un segment prédit exposé au compartiment interne se trouve en fait accessible depuis l'extérieur, confirmant les résultats obtenus au laboratoire par photomarquage (Figure 3) et 2/ l'état conformationnel du transporteur, contrôlé par la présence de CATR ou de BA module cette accessibilité. Ceci met en évidence qu'une boucle peptidique matricielle connectant deux segments transmembranaires pénètre la membrane pour devenir accessible depuis la face opposée de la membrane. De plus, les mouvements de cette boucle sont associés aux changements de conformation du transporteur.

Figure 3 : Arrangement du transporteur ADP/ATP de levure dans la membrane mitochondriale. Les piliers transmembranaires hydrophobes du transporteur sont repérés par les chiffres I-VI. Les régions photomarquées par le 2-azido-naphtoyl-ADP (figurées en trait épais rouge) et le site de coupure trypsique accessibles depuis la face cytosolique du transporteur soutiennent l'hypothèse d'une région peptidique organisée en boucle hydrophile "ré-entrante".

Une seconde approche a été basée sur le marquage chimique d'un thiol utilisé comme cible spécifique. Pour cela, un résidu de cystéine a été introduit par mutagenèse dirigée dans la boucle "ré-entrante" décrite ci-dessus. L'approche de mutagenèse envisagée ici ne visait pas à faire disparaitre une fonction, mais à introduire un résidu "rapporteur" dans une protéine active. La viabilité des levures contenant le transporteur modifié a donc été vérifiée en suivant la croissance des cellules sur une source de carbone non fermentescible.
La modification du résidu de cystéine par divers réactifs alkylants non perméants, a été réalisée en présence de CATR ou de BA, et suivie par coupure trypsique/spectrométrie de masse MALDI. Les résultats ont confirmé de manière très claire à la fois l'accessibilité de cette boucle peptidique matricielle à des réactifs ajoutés dans le mileu extérieur, mais également sa flexibilité.
Ces résultats confirment la dynamique conformationnelle du transporteur déjà observée pour le transporteur bovin ; ils permettent d'établir que la région centrale de la protéine joue un rôle majeur dans le processus du transport ADP/ATP.

Une stratégie a été mise en place pour augmenter le nombre de régions hydrophiles du transporteur mitochondrial Anc2p de la levure S. cerevisiae et ainsi en faciliter la cristallisation : elle a consisté à fusionner par voie génique le transporteur au cytochrome c (Figure 4A). Ce dernier a été choisi parce qu'il est une protéine exclusivement mitochondriale, de petite taille, et dont la structure 3D est connue. De plus, le cytochrome c, naturellement disposé sur la face externe de la membrane mitochondriale interne, conservait cette localisation une fois attaché soit à l'extrémité N-terminale ou à l'extrémité C-terminale du transporteur Anc2p, toutes deux exposées vers l'extérieur.

Figure 4 :
A - la protéine de de fusion Anc2p-cyc1.
B - Analyse de la complémentation de la souche de levure JL1-3 par les gènes codant le transporteur Anc2p ou la chimère Anc2p-cyc1.


La pertinence de l'approche exigeait que les protéines chimères soient fonctionnelles, ce qui a été établi (Figure 4B). La purification de la chimère Anc2p-cyc1, préférentiellement retenue, a été optimisée pour entreprendre à court terme des essais de cristallogenèse.

L'extension de nos travaux vers le transporteur ADP/ATP humain, et en particulier de ses variants impliquées dans des pathologies, fait obligatoirement appel à l'expression de cette protéine dans un système hétérologue.

Dans un travail récent, chacun des trois isogènes du transporteur mitochondrial ADP/ATP humain (HANC) ont été exprimés dans une souche de la levure S. cerevisiae dans laquelle les gènes naturels codant le transporteur avaient préalablement été inactivés. Chaque isoforme Hanc est capable de complémenter le défaut de croissance de la souche déficiente et les paramètres cinétiques du transport ADP/ATP ont pu être mesurés pour la première fois pour chacune d'entre elles. Parallèlement, nous avons montré dans cette étude par des approches de mutagenèse ponctuelle que l'efficacité d'importation des transporteurs Hanc dans les mitochondries de levure était en grande partie régie par la présence, dans la région N-terminale d'un résidu chargé négativement.
Le système d'expression chez la levure a montré que les mutations A114P et V289M de l'isoforme humaine Hanc1, associées chez des patients à des cas d'ophtalmoplégie progressive externe, conduisent à une déstructuration et/ou à l'inactivation de la protéine. Ces travaux sont poursuivis avec pour examiner les effets de deux autre mutations liées à des pathologies lidentifiées sur Hanc1 : L98P et D104G.

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