Direction des sciences du vivant

Biohydrogène ; photoproduction d'hydrogène ; photofermentation ; biodégradation ; environnement ; biodiversité ; métabolisme.

Les déchets et les sous-produits agricoles représentent une source importante de matière organique, potentiellement convertissible en hydrogène par voie de fermentation. La fermentation classique, dite « à l'obscurité » conduit à la formation théorique de 4 mol H₂ et 2 mol acétate par mol de glucose. En revanche, la fermentation « à la lumière» ou photofermentation, catalysée par les bactéries photosynthétiques, est capable théoriquement à convertir la totalité du glucose en H₂ et CO₂, avec un rendement maximal de 12 mol H₂/mol de glucose. En pratique, le rendement de production d'H₂ par fermentation à l'obscurité est de l'ordre de 2 mol/mol glucose par les bactéries mésophiles et de 3 mol/mol glucose pour les bactéries hyperthermophiles, avec la formation d'autres sous-produits, comme le butyrate ou le lactate. De même, le rendement de photofermentation est faible pour les sucres (environ 30%) mais beaucoup plus élevé pour les acides organiques, comme l'acétate et le lactate. La solution que nous étudions actuellement est de coupler un processus de fermentation à haute température, avec un rendement expérimental de 75%, à un processus de photofermentation qui présente également un rendement expérimental de 75% de conversion de l'acétate en H₂.

La bactérie photosynthétique que nous étudions est la souche B10 de Rhodobacter capsulatus. Cette souche a été bien caractérisée sur le plan physiologique, biochimique et génétique, et son génome a été séquencé. La génétique et régulation de la fixation d'azote, catalysée par la nitrogénase, ont été particulièrement étudiées. La nitrogénase est une métalloenzyme contenant du Fe et du Mo au site actif, et les électrons et l'ATP nécessaire pour son activité sont fournis par la photosynthèse. En fait, à la différence des plantes et des micro-algues, la photosynthèse bactérienne ne produit pas d'oxygène et les électrons pour la réduction du photosystème proviennent de substrats organiques et non pas de l'eau. Le transfert des électrons vers la nitrogénase implique une ferrédoxine à 4Fe-4S et un complexe membranaire appelé «Rnf » composé de protéines à Fe-S et de protéines transmembranaires [Jouanneau et al., 1998]. Durant son activité catalytique, la nitrogénase produit un mol H₂ par mol de N₂ réduit, et en absence d'azote, la nitrogénase continue à réduire des protons en H₂. R. capsulatus contient une hydrogénase « uptake » qui peut éventuellement consommer l'H₂ produit par la nitrogénase ; mais elle ne contient pas d'hydrogénase réversible. La nitrogénase est donc la seule enzyme responsable de la production d'hydrogène chez cette bactérie. Comme les électrons utilisés pour la réduction des H⁺ proviennent de substrats carbonés, la réaction globale effectuée par la bactérie lors de la photoproduction d'H₂ à partir du lactate, par exemple, est la suivante :

C₃H₆O₃ + 3H₂O -----> 6H₂ + 3CO₂

La plupart du CO₂ produit lors de l'oxydation des acides organiques comme le lactate, est piégé dans le milieu de culture sous forme de bicarbonate. De ce fait, le biogaz produit est très pur (>95% H₂) et peut être utilisé directement dans des piles à combustibles. Le couplage entre des cultures photosynthétiques de R. capsulatus et des piles à combustibles de type PEM-FC [He et al., 2005] et SOFC (Figure 1) a été démontré en collaboration avec le laboratoire LEPMI (Grenoble-INP) dans le cadre du projet SOBBRE financé par la Région Rhône-Alpes (2003-2006).



Figure 1 :
A - Culture photosynthétique de Rhodobacter capsulatus IR3 (1 litre) produisant de l’hydrogène à partir du lactate avec un débit de 2 ml/min.
B - Pile à combustible de type PEMFC (PolyElectrolyte Membrane Fuel Cell) de 64 cm^₂, reliée à un voltmètre et faisant tourner une petite hélice.

L'expérience de couplage avec une pile PEM-FC a été mise en démonstration au Palais de la Découverte (Figure 2).



Figure 2 :
A - Culture photosynthétique de Rhodobacter capsulatus B10 (20 litres). L’hydrogène produit est entraîné par de l’argon avec un débit total de 2 L/min.
B - Four à 800°C contenant une pile à combustible de type SOFC (Solid Oxide Fuel Cell).

Plusieurs types de mutants de R. capsulatus ont été isolés qui montrent des capacités accrues de photoproduction d'hydrogène. Un mutant en particulier, la souche IR3, produit de l'hydrogène plus vite et pendant plus longtemps que les autres souches testées dans les mêmes conditions [He et al., 2005]. Nous cherchons à identifier la (ou les) mutation(s) responsable(s) du phénotype de cette souche. Ce mutant a été identifié dans un premier temps par son incapacité à se développer dans des conditions d'autotrophie, c'est-à-dire, avec H₂ + CO₂ comme seules sources d'énergie et de carbone [Willison et al., 1984]. Néanmoins, l'activité des enzymes spécifiques à la croissance en autotrophie (phosphoribulokinase, ribulose-bis-phosphate carboxylase, hydrogénase) s'est avérée quasi-normale. Il est possible que la mutation induise un phénomène de régulation qui affecte la fixation du CO₂ et, indirectement, la photoproduction d'hydrogène par la nitrogénase.

Plus généralement, nous cherchons à comprendre pourquoi chez R. capsulatus le rendement de conversion en H₂ des substrats organiques est < 100%, variant de 30% pour les sucres à 70-80% pour les acides dans des conditions optimales. Nous avons identifié d'autres sous-produits de photofermentation, mais qui sont produits en quantités trop faibles pour expliquer l'écart entre le rendement théorique et expérimental. L'analyse précise des composants cellulaires et extracellulaires, notamment des métabolites intracellulaires et des polysaccharides, nous permettra éventuellement de connaître le devenir de l'ensemble du substrat dans des conditions de photoévolution d'hydrogène. Nous envisageons notamment d'utiliser la technique bioinformatique de l'analyse des flux métaboliques (MFA) pour modéliser le métabolisme cellulaire afin d'optimiser par ingénierie métabolique le taux de conversion des substrats en H₂ [Hadike et al., 2011; Tao et al., 2012].

Ce travail sera effectué dans le cadre d'un projet de collaboration financé par le programme Bioénergies 2010 de l'ANR. Ce projet, dont le CEA-Grenoble (John Willison) est coordinateur, s'intitule HYCOFOL_BV (Production d'HYdrogène par Couplage de procédés de Fermentation à l'Obscurité et à Lumière appliqué à la Biomasse Végétale) et regroupe 4 autres partenaires : CNRS, Grenoble ; IRD, Marseille ; BRGM, Orléans ; ARD, Pomacle (Reims). Il a pour objectif de proposer un procédé de production biologique d'hydrogène à partir d'une biomasse végétale (la paille de blé) en associant une étape de fermentation à haute température par des bactéries hyperthermophiles du genre Thermotoga à une étape de photofermentation par une bactérie photosynthétique du genre Rhodobacter. Chaque étape sera optimisée en fonction de l'autre, en utilisant des approches de microbiologie et de biochimie, mais aussi celles du génie des procédés (utilisation des plans d'expériences, étude de la configuration des bioréacteurs,...)

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants récalcitrants à cause de leur stabilité chimique et leur faible solubilité dans l'eau. L'utilisation d'une phase organique, immiscible dans l'eau, pour solubiliser des HAP augmente leur biodisponibilité et facilite leur biodégradation. Nous avons mis au point un milieu de culture biphasique dans lequel les HAP sont solubilisés dans une huile minérale comme l'huile de silicone. Ce milieu a été utilisé pour isoler à partir de sols pollués de nouvelles souches bactériennes capables de se développer sur des HAP lourds, comme le pyrène [Krivobok et al., 2003] et le chrysène [Willison, 2004]. Dans ce milieu, suffisamment de biomasse bactérienne est produite pour pouvoir effectuer des analyses biochimiques des enzymes impliquées et des métabolites intermédiaires dans les voies de dégradation de ces HAP. Certains métabolites identifiés peuvent servir d'indicateurs de la présence et la biodégradation des HAP dans l'environnement [Jouanneau et al., 2005].

Des études physiologiques de la souche Mycobacterium sp. 6PY1, qui dégrade le pyrène, et de Sphingomonas sp. CHY-1, qui dégrade le chrysène, dans un milieu de culture biphasique, ont mis en évidence des phénomènes d'adaptation ainsi que des interactions plus ou moins fortes avec la phase huile [Abdelhay et al., 2008, 2009] (Figure 3).



Figure 3 A :
Micelle de diamètre 100 µm environ enfermant des bactéries de la souche Mycobacterium sp. 6PY1 après culture sur milieu biphasique + pyrène.



Figure 3 B :
Vue sur une goutte d’émulsion de huile d’environ 200 µm de diamètre avec des bactéries adhérées à la surface (Mycobacterium sp. 6PY1, culture biphasique sur pyrène).

Ces facteurs influencent le taux de dégradation des HAP dans la phase huile et provoquent des changements importants dans le profil des métabolites qui s'accumulent lors de la biodégradation. La compréhension de ces mécanismes serait importante dans l'optique de l'utilisation de ces milieux biphasiques pour la bioremédiation. Dans ce contexte, la méthode des plans d'expériences a été utilisée pour optimiser la biodégradation des HAP dans des boues industrielles (boues de hauts-fourneaux) co-contaminés avec des métaux lourds. Un taux de dégradation de 95% en 10 jours a été obtenu dans des conditions optimisées. La bioaugmentation des boues par la souche Sphingomonas sp. CHY-1, qui dégrade une gamme très large d'HAP dont des dérivés alkylés, n'a pas eu d'effet sur la biodégradation, probablement à cause de la forte teneur en métaux lourds, notamment du Zn. Plusieurs souches bactériennes résistantes aux métaux lourds ont été isolées des boues [Cheik et al., 2010] et la résistance au Zn a été transférée d'une entre elles, Methylobacterium sp. BHF005, à Sphingomonas sp. CHY-1 par conjugaison sur milieu gélosé.

Pierre Caumette / Robert Duran, Université de Pau et des Pays de l'Adour, IPREM-EEM, UMR CNRS 5254, Équipe Environnement et Microbiologie, IBEAS, UFR Sciences et Technologies, BP 1155, 64013 Pau cedex

Jean-Pierre Magnin, Grenoble-INP, LEPMI, UMR 5631 (CNRS-INPG-UJF), Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces, BP 75, 38402 St. Martin d'Hères cedex.

Muriel Raveton, Université Joseph Fourier, LECA-P3E, UMR CNRS 5553, Laboratoire d'Ecologie Alpine, BP 53, 38041 Grenoble Cedex 09.

Eric Latrille/ Eric Trably, Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement, INRA-LBE, Avenue des Etangs, 11100 Narbonne

Willison JC
Isolation and characterization of a novel sphingomonad capable of growth with chrysene as sole carbon and energy source.
FEMS Microbiology Letters, 2004, 241: 143-150

Krivobok S, Kuony S, Meyer C, Louwagie M, Willison JC and Jouanneau Y
Identification of pyrene-induced proteins in Mycobacterium sp. 6PY1: Evidence for two ring-hydroxylating dioxygenases.
Journal of Bacteriology, 2003, 185: 3828-3841

Jouanneau Y, Jeong HS, Hugo N, Meyer C and Willison JC
Overexpression in Escherichia coli of the rnf genes from Rhodobacter capsulatus--characterization of two membrane-bound iron-sulfur proteins.
European Journal of Biochemistry, 1998, 251(1-2): 54-64

Willison JC, Madern D and Vignais PM
Increased photoproduction of hydrogen by non-autotrophic mutants of Rhodopseudomonas capsulata.
Biochemical Journal, 1984, 219(2): 593-600