Direction des sciences du vivant

Charline Cicuttini, Étudiante BTS
Christelle Caux-Thang, Technicienne CNRS
Victor Duarte, Chercheur CNRS
Jean-Marc Latour, Chercheur CEA

Le peroxyde d'hydrogène est un produit de la respiration aérobie qui résulte de la réduction incomplète du dioxygène. Il est produit par de nombreuses enzymes, telles les oxydases et les superoxyde dismutases. Cependant, en tant que précurseur du radical hydroxyle, H₂O₂ est néfaste pour les cellules. Celles-ci disposent d'une machinerie enzymatique capable de le détruire (catalases, peroxydases) ou de détruire ses dérivés (alkylhydroperoxyde réductases). En fonctionnement normal, ces enzymes sont maintenues à un niveau basal. En situation de stress peroxydique, ce niveau est insuffisant et la synthèse des enzymes de défense doit être effectuée.

Dans de nombreuses bactéries les gènes codant pour ces enzymes sont placés sous le contrôle d'un répresseur lié à l'ADN. Sous l'action d'H₂O₂, ce facteur de transcription, senseur d'H₂O₂, libère l'accès de l'ARN polymérase et permet la synthèse des protéines de défense. À ce jour, le régulateur OxyR de la réponse au stress peroxydique chez E. coli a été le plus étudié (Choi et al., Cell, 2001, 105: 103-113). Cette protéine régule, entre autres, la synthèse d'une hydroperoxydase, une glutathion réductase, une protéine de protection de l'ADN et un ARN régulateur. Chez Bacillus subtilis et de nombreux microorganismes pathogènes, un système de régulation en réponse au peroxyde d'hydrogène a été récemment identifié (Mongkolsuk and Helmann, Molecular Microbiology, 2002, 45: 9-15). La protéine PerR (Peroxide resistance Regulator) est activée par H₂O₂ et joue à ce titre un rôle analogue à celui de OxyR chez E. coli. La littérature indique que la protéine PerR présente deux sites métalliques : un site à zinc (dit structural) et un site à fer ou manganèse (dit régulateur). Des études biologiques ont montré qu'en présence du métal activateur Mn²⁺ ou Fe²⁺, la protéine PerR-Zn-Fe sous forme dimère se fixe sur l'ADN et que l'adduit est dissocié par action d'H₂O₂ (Herbig and Helmann, Molecular Microbiology, 2001, 41: 849-859). Cette inactivation de PerR-Zn-Fe par H₂O₂ résulte de l'oxydation de deux résidus histidine ligands du fer en 2-oxo-histidines (Lee and Helmann, Nature, 2006, 440: 363-367). Un mécanisme de type Fenton a été proposé pour expliquer cette réaction, mais le rôle du radical hydroxyle dans l'oxydation de PerR n'a pas été clairement démontré (Figure 1).



Figure 1 : Formation de la 2-oxo-histidine.
Le radical hydroxyle formé par la réaction de Fenton (A) réagit très rapidement avec l'histidine (B)

Nous avons récemment, en collaboration avec le Groupe Synchrotron du Laboratoire de Cristallographie et Cristallogenèse des Protéines de l'Institut de Biologie Structurale (Grenoble), résolu la structure cristallographique de la protéine PerR (forme apo-PerR-Zn inactive) à 1,7 Å de résolution (Figure 2) (Traoré et al., 2006 : en savoir plus).


Figure 2 : Représentation de la structure de la protéine apo-PerR-Zn.
Monomère A : rouge (partie N-terminale), orange (partie C-terminale). Monomère B : vert.

De façon inattendue, cette structure montre que les 4 cystéines de la protéine sont impliquées dans la coordination d'un atome de zinc (Figure 3). Des expériences de biochimie indiquent que ce site à zinc, peu sensible à H₂O₂, joue un rôle essentiellement structural dans la stabilisation du dimère (Traoré et al., 2006). Par ailleurs, un alignement des séquences des protéines PerR et « PerR-like » montre que les cystéines de cette famille de protéines, présentes sous forme de 2 motifs -CXXC-, sont fortement conservées. Cette observation suggère qu'un motif structural du type Zn(Cys)₄ peut être distinctif de cette classe de régulateurs.

Figure 3 : Zoom du site à zinc Zn(Cys)₄ de la protéine PerR

Des essais de modélisation moléculaire basés sur la structure de la protéine apo-PerR-Zn et celle de la protéine Fur de Pseudomonas aeruginosa (forme active) nous ont permis d'identifier un deuxième site métallique. Ce site potentiel de régulation qui fait intervenir 5 ligands (3 His et 2 Asp) est en parfait accord avec la littérature qui démontre par des données biochimiques l'importance de ces ligands dans l'activation de PerR (Figure 4) (Lee and Helmann, Nature, 2006, 440: 363-367). La fixation du fer à la protéine apo-PerR-Zn engendrerait un changement de conformation de la protéine de sorte que les deux hélices (en rouge sur la figure 4a) du dimère puissent interagir avec l'ADN.


Figure 4 : Modèle structural de la forme active de PerR (A). Zoom sur le site potentiel de régulation (B).

• Duarte V and Latour JM
PerR vs OhrR: Selective peroxide sensing in Bacillus subtilis.
Molecular BioSystems, 2010, 6(2): 316-323

• Jacquamet L, Traore DA, Ferrer JL, Proux O, Testemale D, Hazemann JL, Nazarenko E, El Ghazouani A, Caux-Thang C, Duarte V and Latour JM
Structural characterization of the active form of PerR: Insights into the metal-induced activation of PerR and Fur proteins for DNA binding.
Molecular Microbiology, 2009, 73(1): 20-31

• Traoré DA, El Ghazouani A, Jacquamet L, Borel F, Ferrer JL, Lascoux D, Ravanat JL, Jaquinod M, Blondin G, Caux-Thang C, Duarte V and Latour JM
Structural and functional characterization of 2-oxo-histidine in oxidized PerR protein.
Nature Chemical Biology, 2009, 5: 53-59

• Traoré D, El Ghazouani A, Ilango S, Dupuy J, Jacquamet L, Ferrer JL, Caux-Thang C, Duarte V and Latour JM
Crystal structure of the apo-PerR-Zn protein from Bacills subtilis.
Molecular Microbiology, 2006, 61(5): 1211-1219

• Champier L, Duarte V, Michaud-Soret I and Coves J
Characterization of the MerD protein from Ralstonia metallidurans CH34: A possible role in bacterial mercury resistance by switching off the induction of the mer operon.
Molecular Microbiology, 2004, 52: 1475-1485