Synthèse de conjugués flavine - et déazaflavine – oligonucléotide : étude de la reconnaissance d'une séquence complémentaire et de la réduction par la flavine réductase.
Synthesis of flavin- or deazaflavin-oligonucleotide conjugates. Study of hybridization with RNA or DNA complementary sequences and enzymatic reduction.
Ce travail avait pour but la mise au point d’un système permettant la destruction enzymatique d’un acide nucléique viral. L’approche développée consiste à fixer un substrat d’enzyme, une flavine substrat de la flavine réductase, à l’extrémité d’oligonucléotides antisens ou anti-gène formant respectivement une double hélice avec un simple brin d’acide nucléique ou une triple hélice avec un double brin d’ADN. La réduction de cette flavine par la flavine réductase conduit à la dihydroflavine qui est oxydée immédiatement par le dioxygène présent avec production concomitante de radicaux oxygénés. En contraignant ce système enzymatique à fonctionner à proximité de la cible d’acide nucléique par l’intermédiaire d’un conjugué flavine-oligonucléotide complémentaire, des coupures sélectives sur cette cible pouvaient ainsi être produites. La méthode développée précédemment pour fixer une flavine modifiée à l’extrémité 5’ d’oligonucléotides a permis de synthétiser plusieurs conjugués flavine-oligonuclétide (Frier, Décout & Fontecave, J. Org. Chem., 1997, 62: 3520). Elle a aussi été adaptée pour permettre l’accrochage d’une déazaflavine à différents oligonucléotides, les déazaflavines pouvant être comme les flavines des outils photochimiques intéressants. Des études de températures de fusion, de retards sur gel, et de fluorescence ont montré que la flavine et la déazaflavine ainsi liées à des oligonucléotides stabilisent les doubles et les triples hélices dans lesquelles elles sont impliquées. Cependant, il n’a pas été possible de mettre en évidence des coupures sélectives de la cible par irradiation ou par activation enzymatique.
In this work, we wanted to develop a new strategy for the activation of antisense or anti-gene oligonucleotides. Rather than attaching a chemically activable group to oligonucleotides, we choose to prepare oligonucleotides tethered to enzyme substrate. The substrate here is a riboflavin analog since riboflavin can be efficiently reduced by the enzyme flavin reductase. The dihydroflavin produced can be immediatly oxidized by dioxygen with the cocomitant production of oxygen radicals. Thus, a double or a triple-helix-forming oligonucleotide tethered to a flavin ring could be activated enzymatically with flavin reductase. A method previously developed for tethering flavin to oligonuclotides was used for the synthesis of various conjugates (Frier, Décout & Fontecave, J. Org. Chem., 1997, 62: 3520) and was adapted for preparing deazaflavin-oligonucleotide conjugates, wich are potentially interesting photochemical tools. Melting point, gel electrophoresis and fluorescence studies revealed a stabilization of the duplex or triplex formed with the complementary sequence. Irradiation of the (deaza)flavin in the duplex or triplex strucure did not lead to a selective cleavage of the RNA od DNA target.
Soutenue le 12 janvier 2001 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I Sciences & Géographie - Discipline : Chimie
