La ribonucléotide réductase anaérobie d’Escherichia coli, une protéine à zinc. Importance du site métallique pour la structure et l’activation de l’enzyme.
The anaerobic ribonucleotide reductase from Escherichia coli, a zinc protein. Importance of the metal-binding site for the enzyme structure and activation.
Les ribonucléotides réductases (RNRs) sont des enzymes ubiquitaires essentielles pour la synthèse d’ADN. La croissance en anaérobiose d’Escherichia coli dépend d’une RNR de classe III. L’enzyme activée contient un radical sensible à l’oxygène situé sur le résidu G681 dont la formation implique l’intervention concertée d’une protéine activatrice fer-soufre, de S-adénosylméthionine, de dithiothréitol (DTT), et d’un système réducteur. La structure cristallographique de la RNR du bactériophage T4 a révélé la présence d’un site métallique Zn(Cys)4 dans la partie C-terminale de la réductase. Dans ce travail nous avons défini de nouvelles conditions de purification conduisant à des enzymes très actives, montré que le zinc contrôle la structuration de la boucle Cter contenant le site radicalaire et que, contrairement à ce qui était admis depuis plus de 15 ans, le DTT n’intervient pas dans la formation du radical Gly• mais plutôt dans les transferts radicalaires entre Gly• et le substrat.
Ribonucleotide reductases (RNRs) are critical enzymes for the de novo synthesis of DNA in all organisms. For its anaerobic growth, Escherichia coli depends on a class III RNR, which harbors in its active form an oxygen-sensitive free radical located on the Gly681 residue, the formation of which involves the concerted action of four components: an activating iron-sulfur protein, S-adenosylmethionine, dithiothreitol (DTT), and a reducing system. A Zn(Cys)4 center has recently been found in the C-terminal region of the crystal structure of the RNR from bacteriophage T4. In this work we define new conditions allowing for the preparation of a high specific activity reductase. We show that the zinc site controls the structuration of the Cter loop carrying the radical site. Finally we demonstrate that DTT is not essential for radical formation but rather acts on radical transfer reactions between Gly• and the substrate.
Soutenue le 10 novembre 2006 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie structurale
