Direction des sciences du vivant

Mes travaux de thèse ont consisté d’une part en l’étude fonctionnelle de l’ATPase-Cd²⁺, CadA de Listeria monocytogenes, d’autre part en la compréhension des mécanismes de toxicité et de réponse vis-à-vis du cadmium chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L’originalité de ce travail repose sur l’utilisation d’un phénotype de sensibilité au cadmium associé à l’expression de CadA dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce phénotype s’est révélé être d’une part, un système de criblage pertinent pour l’identification des acides aminés essentiels au fonctionnement de CadA et d’autre part, un système d’étude de la toxicité du cadmium et des moyens de réponse de la levure vis-à-vis d’une exposition au cadmium. CadA est une ATPase-P qui transporte les ions cadmium d’un côté à l’autre d’une membrane en utilisant l’hydrolyse de l’ATP comme source d’énergie. La mutagenèse dirigée des acides aminés transmembranaires chargés, soufrés ou polaires a permis de mettre en évidence les principaux constituants de la voie de passage des ions Cd²⁺ au sein de CadA. Mes travaux montrent que deux ions Cd2+ seraient transportés par molécule d’ATP hydrolysée et que les sites de transport du métal impliquent les cystéines C354, C356 et la proline P355 du motif CPC de l’hélice 6, l’acide aspartique D692 de l’hélice 8, l’acide glutamique E164 de l’hélice 4 et la méthionine M149 de l’hélice 3. L’expression de CadA dans la levure Saccharomyces cerevisiae rend cette dernière hypersensible au cadmium. En effet, alors qu’une souche sauvage est capable de croître en présence de 100µM de cadmium, la souche exprimant CadA est incapable de se développer sur un milieu contenant 1µM de cadmium. L’utilisation de ce phénotype a permis de montrer que l’entrée du cadmium se fait principalement par le transporteur de manganèse Smf1p. La sensibilité au cadmium d’une levure exprimant CadA résulte d’une accumulation de cadmium dans le réticulum endoplasmique, accumulation réalisée par l’ATPase elle-même. Dans le réticulum endoplasmique, le cadmium altère le processus de repliement, ce à quoi la levure répond en déclenchant la réponse UPR. Cette réponse est aussi observée chez une levure normale, ce qui fait du réticulum endoplasmique une des principales cibles de la toxicité du cadmium. Le déclenchement de la réponse UPR est un phénomène précoce de réponse à l’intoxication par le cadmium qui se met en place bien avant les premiers effets phénotypiques.

Two projects has been developed during my PhD. One consisting in the functional study of CadA, the Cd²⁺-ATPase from Listeria monocytogenes, the other one was focused on the toxicity of cadmium and the associated response of the yeast Saccharomyces cerevisiae. This two studies used a a phenotype of sensitivity to cadmium induced by CadA expression in yeast. This phenotype was used as a screening tool to identify essential amino acids of Cd transport by CadA and to study cadmium toxicity and the corresponding yeast cellular response. CadA actively transports Cd using ATP hydrolysis as energy source. Directed mutagenesis of the membranous polar, sulphur and charged amino-acids revealed that Cd transport pathway implied four transmembrane segments (Tm) and more precisely the cysteine C354, C356 and proline P355 of the CPC motif located in Tm6, aspartate D692 in Tm8, glutamate E164 in Tm4 and methionine M149 in Tm5. From our studies, 2 Cd ions would be translocated for each hydrolysis ATP. Expression of CadA in the yeast Saccharomyces cerevisiae induces an hypersensitivity to Cd. A wild type cell can grow up to 100µM cadmium whereas CadA expressing yeast cannot grow with 1µM cadmium in the culture medium. This cadmium sensitivity was due to the localisation of CadA in the endoplasmic reticulum membrane. Transport of cadmium in this compartment poduces an accumulation of misfolded proteins that induces the Unfolded Protein Response (UPR). As UPR also occurs in a wild type yeast exposed to low Cd concentration, one can point out endoplasmic reticulum as a extremely sensitive cellular compartment. UPR also appears as an early response to Cd as it happens far before any visible signs of toxicity.