Direction des sciences du vivant

Dans les neurones, la stabilité des microtubules est induite par leur association avec deux protéines associées aux micotubules, les protéines E- et N-STOP (Early and adult neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne des défauts de la transmission synaptique associée à une réduction du nombre de vésicules synaptiques.
Les neurones matures contiennent également une protéine apparentée à la protéine N-STOP, la protéine SL21 (STOP like protein of 21 kDa) qui possède deux zones homologues aux protéines STOPs : un domaine homologue au domaine de liaison et de stabilisation des microtubules et une région de 35 acides aminés située à l'extrémité amino-terminale. Cette protéine se localise à la fois au niveau de l'appareil de Golgi et des microtubules.
La première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation fonctionnelle du domaine amino-terminal. Il contient 3 résidus cystéines en position 5, 10 et 11 qui peuvent être palmitoylée (modification permettant l'association des protéines aux membranes). Nous avons montré que les cystéines 5 et 11 de SL21 sont palmitoylables mais que seule la cystéine 5 est suffisante et nécessaire pour localiser SL21 au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons également mis en évidence que la protéine STOP, en plus d'être localisée aux microtubules, s'associe également au Golgi par l'intermédiaire de son domaine amino-terminal homologue à SL21 et qu'elle est aussi palmitoylable.
Dans la deuxième partie de ce travail, pour mieux comprendre la fonction de SL21, nous nous sommes intéressées aux partenaires de SL21. Un criblage ciblé en Double-Hybride, utilisant comme protéines cibles des protéines connues comme étant des partenaires de STOP, a été réalisé au laboratoire. Trois partenaires potentiels ont été mis en évidence : la protéine Tctex1, une des chaînes légère du moteur moléculaire dynéine. Nous avons confirmé l'interaction de ces protéines avec SL21 par co-immunoprécipitation après surexpression dans les cellules et aussi, à partir d'un extrait de cerveau pour l'interaction de SL21 et de STOP. Nous avons également déterminé leur site d'interaction au niveau de SL21. La protéine Tctex1 interagit avec SL21 au niveau de son module de liaison aux microtubules, le site de multimérisation de SL21 se localise au niveau du domaine amino-terminal, pouvant impliquer la palmitoylation de ces protéines.
L'ensemble de ces résultats permet d'envisager un rôle des protéines STOPs au niveau de la régulation de la relation microtubule-membrane des vésicules synaptique au sein de la synapse.

The deletion of the rotund (rn) locus of Drosophila melanogaster induces a short adult appendage phenotype and male sterility. The molecular characterisation of the rn region indicates that it encodes two major transcription units: the rn unit that has been implicated in appendage morphogenesis (S. Saint Pierre, personal communication), and the rnRacGAP transcription unit that is essential during spermatogenesis (Bergeret et al., 2001). We showed using molecular biological analyses and fertility tests, that rn mutants having an intact and functional rnRacGAP transcription unit, presented partial fertility. Moreover, microscopic analysis of the reproductive apparatus of these mutants indicated that they are capable of producing motile spermatozoa, stocked in seminal vesicles. By transgenic experiments and inducing multiple recombination events, we showed that the fertility of these mutants is sensitive to rnRacGAP dosage and the genetic background. The protein product RotundRacGAP (RnRacGAP) shows high sequence similarity with the human MgcRacGAP (Male Germ Cell RacGAP) protein, which is a GAP (GTPase Activating Protein) known to have a specific activity in vitro, toward the Rho-GTPases Rac and Cdc42. Therefore, in a second step, we undertook biochemical analyses to test whether RnRacGAP showed GAP activity toward Rho-GTPases. We showed that the Rho-GTPases Rac and Cdc42 are the specific substrates of RnracGAP, in vitro. Moreover, the loss of a dose of rnRacGAP enhances the phenotype induced by over-expression of Rac and Cdc42 in the eye, indicating that RnRacGAP negatively regulates these two targets, in vivo. We have also used, as a model system, dorsal closure during embryogenesis, which is known to be controlled by the Rho-GTPases, to dissect the effects of the over-expression of RnRacGAP on Rho-GTPase-dependent cell signalling. We showed that the expression of RnRacGAP in the embryo affects actin cytoskeleton organisation and, under certain conditions regulates gene expression in the Rac/Jun N-terminal kinase signalisation pathway. Finally, to define connections between RnRacGAP and other cell signalling pathways and the molecular mecanisms of their interactions, we have performed a misexpression screen and identified new genetic partners of RnRacGAP.