Direction des sciences du vivant

Les microtubules assurent de nombreuses fonctions essentielles dans la cellule. La concentration en dimère de tubuline libre, la brique de base des microtubules, influe très fortement sur l'assemblage et la dynamique des microtubules. Les protéines interagissant directement avec les microtubules, et/ou le dimère de tubuline sont des effecteurs reconnus de cette dynamique. Notre objectif a été d'identifier de manière systématique toutes les protéines liant le dimère de tubuline sous sa forme native. Pour cela, nous avons développé une stratégie basée sur une colonne de chromatographie couplée à un mode d'identification des protéines par spectrométrie de masse.
L'identification de protéines déjà connues pour interagir directement avec la tubuline, comme la stathmine et la tubuline chaperonne d, permet de valider notre approche. D'autres protéines, déjà connues pour interagir avec les microtubules, sont identifiées comme liant le dimère de tubuline, c'est le cas de MAP2, Kif21A, TOGp et E-MAP115. Nous montrons dans cette étude, par d'autres méthodes que la chromatographie, que l'orthologue de TOGp chez Xénope, la protéine XMAP15, lie le dimère de tubuline, suggérant un rôle plus large que celui de reconnaître la structure microtubulaire. Nous avons isolé de nombreuses protéines chaperons de la famille des Hsp90 et Hsp70 ainsi que leurs co-chaperons HOP, Hsp40 et BAG2. Comme l'interaction entre les protéines chaperons et la tubuline et/ou les microtubules est un domaine qui reste controversé, nous nous sommes intéressés à l'un des membres de la famille des Hsp70 : Hsc70. Nous avons montré qu'il n'y a pas d'interaction directe, in vitro, entre Hsp70 et le dimère de tubuline et/ou les microtubules et qu'elle n'affecte pas l'assemblage des microtubules, suggérant un lien direct avec les microtubules dans les cellules. Nous avons aussi identifié des protéines qui sont connues pour avoir un lien indirect avec les microtubules, comme la clathrine et les importines. Enfin, des protéines identifiées n'étaient pas connues pour interagir avec la tubuline comme l'adénosine déaminase, l'ATP-citrate-lyase, APC2 et LRP130.
Certaines protéines identifiées présentent une séquence C-terminale identique à celle de la tubuline α. Nous avons étudié l'interaction avec le dimère de tubuline pour deux d'entre-elles, EB1 et HURP, du fait de leur localisation connue ou supposée avec les microtubules dans les cellules. Nous montrons que ces protéines n'interagissent pas directement avec le dimère de tubuline. Toutefois, cette structure pourrait être fondamentale pour le fonctionnement de ces protéines.

Microtubules play essential roles in a number of cellular processes in cells. Free tubulin concentration influences dramatically microtubule assembly and dynamics. Proteins interacting either with microtubules or with tubulin dimers can modulate microtubule dynamics. Here, we have investigated proteins interacting specifically with native tubulin dimers. For this, an immunoaffinity purification approach was used for proteins isolation and mass-spectrometry for protein identification.
The identification of proteins that were already known to interact with tubulin dimers such as Stathmin or tubulin chaperone d allows us to validate our approach. Moreover, we have found proteins that were known to interact with microtubules such as MAP2, Kif21A, TOGp and E-MAP115 and, using other methods, that XMAP215, the Xenopus ortholog of TOGp, interacts directly with tubulin dimers. This suggests that MAPs may have a new way to regulate mictotubules dynamics. We have isolated members of the large family of chaperones Hsp90 and Hsp70 and co-chaperones HOP, Hsp40 and BAG2. Several studies of the interaction of chaperones with tubulin or microtubulines seen controversial. We set out to investigate properties of one member of the Hsp70 family: Hsc70. We showed, in vitro, that there is no direct interaction between Hsc70 and tubulin dimers and/or microtubules. Moreover, Hsc70 does not affect microtubules assembly. These results suggest that the interaction in the cells with microtubules must be indirect. We also identified proteins that were known to have an indirect connection with microtubules such as clathrin and importin. Finally, we found proteins that were not known to interact with tubulin dimers such as adenosine deaminase, ATP-citrate lyase, APC2 and ERP130.
Few proteins have an identical sequence in the C-terminus than α tubulin. Moreover, we investigate interaction with tubulin dimers with two of them, EB1 and HRURP, because of known or suppose interaction with microtubules. We shnow that there is no direct interaction between them and tubulin dimers. However, we suggest that this structure may be fundamental to the functionality of these proteins.