Direction des sciences du vivant

La biotine (vitamine H ou B8) est synthétisée exclusivement par les plantes et les microorganismes. Dans les cellules végétales, la dernière étape de la voie de biosynthèse de cette vitamine est catalysée par la biotine synthase. Préalablement à cette étude, un ADNc de Arabidopsis thaliana, appelé bio2, avait été caractérisé au laboratoire et la protéine correspondante sur-exprimée dans les cellules d’E. coli, puis purifiée. Cependant, aucune activité biotine synthase n’avait pu être associée à cette protéine, si bien que le mécanisme réactionnel de l’enzyme de plante était inconnu.
Le développement de tests biochimiques sensibles et l’utilisation de bactéries sur-exprimant le produit du gène bio2 d’A. thaliana ont permis, pour la première fois, de détecter et de quantifier précisément une activité biotine synthase de plante. Dans un milieu réactionnel optimisé, le turnover de la réaction est >2h^-1, indiquant que l’enzyme de plante n’est pas, comme cela a été proposé pour l’enzyme bactérienne, un substrat réactionnel. La purification de la protéine recombinante d’A. thaliana indique que Bio2, comme son homologue bactérien, est active sous la forme d’un complexe multi-enzymatique. Dans un système plante reconstitué in vitro, seules les fractions mitochondriales (préparées à partir de feuilles de pois et de tubercules de pomme de terre) restaurent efficacement l’activité biotine synthase associée à la protéine Bio2 purifiée. Un criblage biochimique de la matrice mitochondriale de pomme de terre (fractionnement et reconstitution in vitro de l’activité biotine synthase) et l’analyse des banques de données de Arabidopsis thaliana ont permis d’identifier une adrénodoxine (Adx), une adrénodoxine réductase (AdxR) et une cystéine désulfurase (Nfs1) comme les protéines essentielles à la réaction biotine synthase de plante. Les différents ADNc d’A. thaliana codant chacune de ces protéines ont été clonés dans des vecteurs d’expression, et les protéines correspondantes surproduites dans les cellules d’E. coli. La stimulation de l’activité biotine synthase in vitro par la protéine Nfs1 indique que la cystéine est le donneur de soufre initial pour la biotine dans les mitochondries végétales. La purification de l’Adx1 et de l’AdxR d’A. thaliana a permis d’établir la première caractérisation biochimique d’une réaction Adx/AdxR chez les végétaux supérieurs. Ces deux protéines forment une chaîne de transfert d’électrons à bas potentiel dont l’interaction avec Bio2 est indispensable à l’activité biotine synthase. Ainsi, le produit du gène bio2 d’A. thaliana est le premier partenaire protéique identifié chez les plantes supérieures du système redox Adx/AdxR mitochondrial. Le transfert des électrons entre les différents acteurs moléculaires du complexe biotine synthase de plante nécessite des interactions protéine-protéine, dont une analyse préliminaire a été réalisée. Parallèlement à cela, nous avons initié une étude structurale du produit du gène bio2 d’A. thaliana afin de compléter la caractérisation fonctionnelle de la réaction biotine synthase dans les cellules végétales.
En conclusion, la caractérisation biochimique de la réaction biotine synthase d’A. thaliana démontre l’importance de la mitochondrie végétale dans la biosynthèse de la biotine. De plus, l’identification et la participation du système redox Adx/AdxR matriciel dans la synthèse de cette vitamine ouvrent de nouvelles perspectives de compréhension de la régulation de l’activité biotine synthase dans les cellules végétales.

Biotin (vitamin H or B8) is exclusively synthesized by plants and microorganisms. In plant cells, the last step of the biotin biosynthetic pathway is catalysed by the biotin synthase protein. An Arabidopsis thaliana cDNA, called bio2, had been previously isolated in the laboratory, and the corresponding protein over-expressed in Escherichia coli cells and purified. However, no biotin synthase activity was associated with this protein, so that the mechanism of the plant enzyme reaction was still unknown.
The development of biochemical sensitive tests allowed the first detection and accurate quantification of a plant biotin synthase activity, using protein extracts from bacteria overexpressing the Arabidopsis Bio2 protein. Under optimised assay conditions, the turnover number of the reaction was >2h^-1, indicating that biotin synthase from Arabidopsis is not, as suggested for bacteria, a simple reactant. The purification of the A. thaliana recombinant protein shows that bio2 gene product, like its bacterial counterpart, needs additional proteins to function. In an in vitro plant-reconstituted system, only mitochondrial fractions (prepared from pea leaves and potato tubers) efficiently restore the biotin synthase activity driven by Bio2 protein. A biochemical screening of potato mitochondrial matrix (fractionation and in vitro reconstitution experiments) together with a genomic based research in the A. thaliana databank allowed us to identify mitochondrial adrenodoxin (Adx), adrenodoxin reductase (AdxR) and cysteine desulfurase (Nfs1) proteins as essential components for the plant biotin synthase reaction. Arabidopsis cDNAs encoding these proteins were cloned into expression vectors, and the corresponding proteins overexpressed in E. coli cells. The in vitro stimulation of biotin synthase activity by the Nfs1 protein strongly support the idea that cysteine is the initial sulphur donor for biotin in plant mitochondria. The purification of recombinant Adx and AdxR of A. thaliana enables us to establish the first biochemical characterization of a plant Adx/AdxR reaction. These two purified recombinant proteins formed in vitro an efficient low potential electron transfer chain that interacted with the bio2 gene product to reconstitute a functional plant biotin synthase complex. Thus, Bio2 from Arabidopsis is the first identified protein partner in higher plants for this specific mitochondrial redox chain. The electron transfer between the different components of the plant biotin synthase complex requires protein-protein interactions. A preliminary analysis of these interactions was realized. In parallel, we initiated the structural study of the bio2 gene product of A. thaliana in order to complete the functional characterization of biotin synthase reaction in plant cells.
In conclusion, the biochemical characterization of the A. thaliana biotin synthase reaction demonstrates the importance of plant mitochondria in biotin biosynthesis. Moreover, the identification and the involvement of mitochondrial Adx/AdxR redox chain in this vitamin synthesis opens up future prospects in the understanding of the biotin synthase activity regulation in plant cells.