Direction des sciences du vivant

La GPC, généralement présente en très faible concentration dans les cellules végétales, peut s'accumuler au cours de processus physiologiques impliquant des remaniements membranaires (carences carbonées, germination, basses températures). Le devenir de cette molécule, qui constitue l'extrémité polaire de la phosphatidylcholine, était méconnu chez les cellules végétales.
Des expériences de résonance magnétique nucléaire du ³¹P réalisées sur des cellules de carotte incubées en présence de GPC ont révélé l'existence d'une GPC-phosphodiestérase (GPC-PDE) à la surface des cellules. Cette enzyme clive la GPC en choline et sn-glycérol 3-phosphate, ce dernier étant hydrolysé en phosphate et glycérol par les phosphatases acides de la paroi. La choline et le phosphate sont ensuite incorporés dans la cellule par des transporteurs spécifiques tandis que le glycérol pénètre par diffusion libre ou facilitée. Les trois composés sont métabolisés par la cellule ultérieurement. La GPC-PDE extracellulaire a été localisée dans la paroi des cellules. Par ailleurs, nous avons isolé du suc vacuolaire une deuxième GPC-PDE. Ces deux GPC-PDE sont induites en carence de phosphate.
La protéine responsable de cette activité est inédite chez les végétaux. À partir de parois de cellules de carotte, la protéine a été purifiée et enrichie d'un facteur 2700, ce qui a révélé l'existence d'un polypeptide de 55 kDa co-purifié avec l'activité GPC-PDE. Il s'agit d'une glycoprotéine ayant une forte affinité pour la GPC (K_m de 36µM), mais capable également d'hydrolyser d'autres glycérophosphodiesters comme la glycérophosphoéthanolamine, le glycérophosphoinositol, la glycérophosphosérine et le glycérophosphoglycérol.
Afin de caractériser plus précisément cette protéine, nous avons développé une approche de biologie moléculaire basée sur la recherche d'homologues végétaux d'une phosphodiestérase bactérienne (GLPQ) dont les propriétés s'apparentent à celles de la GPC-PDE de cellules de carotte. À partir d'une EST d'Arabidopsis, nous avons cloné l'ADNc codant l'homologue végétal de la phosphodiestérase GLPQ. L'expression de l'ADNc dans un vecteur bactérien a produit la protéine recombinante en grande quantité. Malheureusement, celle-ci est apparue sous forme de corps d'inclusion, demeurant ainsi inactive. En revanche, les anticorps dirigés contre la protéine recombinante d'Arabidopsis reconnaissent spécifiquement la protéine de 55 kDa. Le séquençage interne de la protéine de 55 kDa et la très forte corrélation entre l'activité GPC-PDE et le marquage montrent que la protéine de 55 kDa, homologue des phosphodiestérases bactériennes, est effectivement responsable de l'hydrolyse de la GPC chez les cellules végétales.

Glycerophosphocholine (GPC) is a diester usually present in plant cells at a low concentration. However, it can accumulate under different physiological processes leading to phospholipid remodeling in higher plant cells. Therefor, the aim of this work was to characterize its catabolism.
³¹P-nuclear magnetic resonance spectroscopy and biochemical analyses performed on carrot cells (Daucus carota) fed with glycerophosphocholine revealed the existence of an extracelllar glycerophosphocholine phosphodiesterase (GPC-PDE). This enzymatic activity splits glycerophosphocholine into sn-glycerol-3-phosphate and free choline. In vivo sn-glycerol-3-phosphate was further hydolyzed in glycerol and inorganic phosphate by acid phosphatases. We vizualized the incorporation and the compartmentation of choline, and observed that the major pool of choline was phosphorylated and accumulated in the cytosol whereas a minor fraction was incorporated in the vacuole as free choline. Extracellular GPC-PDE was localized in the cell wall. We also report the existence of a similar GPC-PDE, located in the vacuole sap. Both extra- and intracellular GPC-PDE activities are widespread among different plant species and are often enhanced during phosphate deprivation.
The enzyme responsible for GPC-PDE activity was purified from carrot cell wall over 2700-fold. A 55 kDa polypeptide was co-purified with GPC-PDE activity. It consists of a glycoprotein that exhibits a high affinity for GPC (K_m=33 µM) and that hydrolyzes GPC and other glycerophosphodiesters (glycerophosphoethanolamine, glycerophosphoinositol, glycerophosphoserine and glycérophosphoglycerol).
Alternatively, a molecular approach was based on the existence of a bacterial GPC-PDE. Indeed carrot GPC-PDE shares commun features with the Escherichia coli glycerol-phosphodiester phosphodiesterase (GLPQ). Therefore, we isolated an Arabidopsis thaliana cDNA clone homologous to GLPC. Overexpression of Arabidopsis thalian cDNA did not yield to any soluble GPC-PDE (accumulation in inclusion bodies). However, antibodies raised against the recombinant protein hybridized specifically with the 55 kDa protein co-purified with GPC-PDE activity. The strong correlation between GPC-PDE activity and the detection of the 55 kDa protein by the antibodies and the sequences deduced from the 55 kDa protein innner fragments indicate that the 55 kDa protein, homologous to bacterial phosphodiesterase, is responsible for the hydrolysis of GPC in plant cells.