Direction des sciences du vivant

L'acide folique (vitamine B9) est un cofacteur indispensable au transport des groupements monocarbonés (métabolisme C1). Il intervient en particulier dans la synthèse des acides nucléiques et joue un rôle important dans le métabolisme de certains acides aminés (glycine, sérine et méthionine). Les plantes, les bactéries et certains protozoaires, contrairement aux animaux, sont capables de synthétiser de novo le folate. La voie métabolique conduisant à la synthèse du folate à partir de la 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptérine comporte cinq étapes enzymatiques. Toutes ces étapes sont présentes dans les mitochondries de feuilles de pois. Nous avons montré que les deux premières, catalysées par la 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptérine pyrophosphokinase (HPPK) et la 7,8-dihydroptéroate synthase (DHPS), sont portées par une seule enzyme bifonctionnelle, exclusivement localisée dans la mitochondrie. Cette protéine a été purifiée à partir de mitochondries de feuilles de pois et elle apparaît comme une protéine mineure de la matrice mitochondriale.
Nous avons isolé et analysé un ADNc codant pour la protéine HPPK-DHPS par criblage d'une banque d'ADNc de feuilles de pois. La séquence primaire de la protéine HPPK-DHPS a ainsi pu être déterminée et révèle la présence d'une séquence d'adressage de type mitochondriale à l'extrémité N-terminale. La séquence primaire de la protéine HPPK-DHPS présente de grande similarité avec les protéines monofonctionnelles HPPK et DHPS bactériennes.
Afin de mieux caractériser le mécanisme enzymatique de cette protéine bifonctionnelle, nous avons choisi d'obtenir une plus grande quantité de protéine en produisant la protéine mature HPPK-DHPS de plante dans un système procaryote. Nous avons réussi a obtenir la protéine HPPK-DHPS recombinante en faible quantité mais présentant des propriétés catalytiques comparables à celles observées pour la protéine mature. Les études des propriétés biochimiques de l'activité DHPS ont montrées que cette réaction est finement régulée par le produit de la réaction, c'est à dire le 7,8-dihydroptéroate, et les autres intermédiaires de la voie de synthèse du folate comme le dihydrofolate et le tétrahydrofolate. De plus, l'activité DHPS est fortement inhibée par les sulfamides, comme l'enzyme bactérienne, et ces composés sont donc aussi des herbicides potentiels. L'étude des propriétés biochimiques de l'activité HPPK a également permis de mettre en évidence un mode de fixation séquentiel ordonné des substrats. Cette activité, fortement couplée à l'activité DHPS, est régulée par les substrats de cette dernière.
Parallèlement, nous avons étudié sur des cultures cellulaires d'Erable, quels sont les différents donneurs d'unités monocarbonées transportées par le folate. Ces études ont été réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire en utilisant des produits marqués ¹³C. Les résultats obtenus mettent en évidence la présence du complexe de la glycine décarboxylase (GDC) au sein de ces cellules non-photosynthétiques. Le catabolisme de la sérine initié par l'activité sérine hydroxyméthyl transférase (SHMT) cytosolique constitue la principale source d'unités monocarbonées. La glycine formée par cette activité est recyclée dans la mitochondrie par le couplage des activités GDC et SHMT mitochondriales pour former une molécule de sérine à partir de deux molécules de glycine. Il se forme ainsi un véritable cycle "glycine-sérine", conduisant, à la formation d'une molécule de CO₂, une molécule de NH₃ et de 2 molécules de 5,10-méthylène-tétrahydrofolate à partir d'une sérine.

One-carbon metabolism in cells is mediated by a variety of tetrahydrofolate polyglutamate derivatives. A number of pathways such as those involved in the metabolism of methionine, serine, purine or thymidylate synthesis are dependent on an endogenous supply of these coenzymes. Plants and micro-organisms, in contrast to animals, are able to synthesize tetrahydrofolate de novo. This pathway requires the sequential operation of five enzymes which are mainly localized in plant mitochondria. In pea leaf mitochondria, the synthesis of 7,8-dihydropteroate, a primary step in folate synthesis, is catalysed by the bifunctional 6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin pyrophosphokinase/7,8-dihydropteroate synthase enzyme (HPPK-DHPS). This bifunctional protein have been purified from pea leaf mitochondria and represents only 0.04-0.06 % of the matrix protein.
We have cloned the cDNA encoding for the HPPK-DHPS, and comparison of the deduced amino acid sequence with the N-terminal sequence of the purified protein indicates that the plant enzyme is synthesised with a putative mitochondrial transit peptide. In addition, Southern blot experiments suggested that a single-copy gene codes for the enzyme.
The reaction catalysed by the DHPS domain behaves like a random bireactant system, and DHPS appears as an important regulatory point of the folate biosynthetic pathway. Indeed, dihydropteroate, dihydrofolate and tetrahydrofolate are strong inhibitors of DHPS activity. This activity is also the target of sulfonamide drugs and is therefore a potential target for herbicides. Biochemical properties of the HPPK domain indicate a sequential ordered system and a regulation by para-aminobenzoic acid, the substrate of DHPS activity. These last result indicates that the two reactions catalysed by this bifunctional protein are tightly coupled.
In plant cells, two reactions are potentially important to provide the C1 units required in C1 metabolism. They are the serine hydroxymethyltransferase (SHMT) and the glycine decarboxylase (GDC). Although the GDC is mostly present in leaf tissues, we observed that it also plays a very important role in non-photosynthetic tissues during serine and glycine catabolism. Serine catabolism in the cytosol is the main source of the C1 units but the resulting glycine is oxidized in mitochondria, thus forming a "serine-glycine" cycle.