Direction des sciences du vivant

En dépit de nombreuses études réalisées sur la mitochondrie végétale, siège de nombreuses biosynthèses, il subsiste sans aucun doute des fonctions mitochondriales à découvrir. Dans la première partie du travail, nous avons entrepris une étude protéomique sur les mitochondries purifiées à partir de différents tissus (feuilles chlorophylliennes, feuilles étiolées, racines et graines) de la plante de pois. Une identification systématique des protéines solubles majeures a été réalisée puis une étude comparative des protéomes a mis en évidence des protéines mitochondriales qui s'expriment de manière spécifique dans certains tissus de la plante. L'étude du protéome soluble mitochondrial des feuilles chlorophylliennes a permis d'établir une carte de référence de 433 spots (correspondant à environ 73% des protéines détectées en masse) où 78 spots ont été analysés par les trois approches : dégradation Edman, Matrix Adsorption Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF) et Electrospray Ionization-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (ESI-MS/MS). Une combinaison d'électrophorèse 2D avec la chromatographie sur gel filtration comme troisième dimension a permis d'identifier les protéines majeures et d'obtenir des informations supplémentaires sur le statut oligomérique des protéines ainsi que sur les interactions protéine-protéine. Une série de protéines attendues sont celles de la voie photorespiratoire (GDC et SHMT) qui représentent 37% de la totalité des protéines. Par ailleurs, la proéminence des aldéhydes déshydrogénases (ALDH, 7,5%) dans les tissus foliaires suggère une fonction antioxydante pour les aldéhydes. Cette méthodologie a également conduit à l'identification de 45 protéines issues de mitochondries purifiées à partir des feuilles étiolées, graines et racines de pois. Notre travail a montré pour la première fois la présence de certaines protéines dans la mitochondrie végétale comme la formate déshydrogénase en tant que protéine majeure dans les graines de pois, les petites chaperonnes HSP 22 ou encore les protéines de maturation de graine (LEA).
Dans la seconde partie de la thèse, une étude biochimique concernant les premières étapes de la voie de biosynthèse des acides gras et de l'acide lipoïque se déroulant dans la mitochondrie végétale, a été entreprise afin de caractériser certaines enzymes impliquées dans l'étape activant le malonate en malonyl-ACP. En combinant la spectrométrie de masse MALDI-TOF et les mesures de marquage, nous avons pu caractériser et purifier l'équipement enzymatique qui permet d'activer le malonate en malonyl-ACP et en acétyl-ACP, les deux précurseurs indispensables à l'initiation de l'élongation des acides gras. Cette activation peut emprunter au moins deux chemins métaboliques : l'un catalysé par la malonyl-ACP synthétase (MAS) et l'autre par la malonyl-CoA synthétase (MCS) couplée à la malonyl-CoA : ACP transacylase (MCAT). La purification des enzymes MAS et MCS devrait être poursuivie afin de préciser leur mécanisme réactionnel au niveau moléculaire. Chez le pois, nous avons mis en évidence deux activités MCAT : chloroplastique et mitochondriale. Comme il existe un seul gène putatif codant pour la MCAT chez Arabidopsis, nous avons démarré des expériences de GFP (green fluorescent protein) afin de préciser la relation entre la localisation subcellulaire et l'existence probable d'au moins de deux isoformes.

In plant mitochondria, site of various biosynthetic reactions, relatively few mitochondrial proteins has been characterised. In the first part, we have undertaken an analysis of plant mitochondria by building the proteome of mitochondria isolated from different tissues: green and etiolated leaves and organs (seeds and roots) from pea. A systematic identification of major soluble proteins was undertaken and a comparison of the 2D-gel maps of soluble proteins from these different tissues highlights the presence of some proteins that were specifically expressed in these tissues. By this analysis, 433 spots were detected in pea leaf mitochondria. Using three different approaches (Edman degradation, MALDI-TOF and ESI-MS/MS), approximately 73 % of proteins are identified of total soluble proteins. We used traditional 2D polyacrylamide gel electrophoresis, in combination with size exclusion chromatography as a third dimension, to identify the major protein and further resolve their macromolecular complexity. A serie of expected major proteins (glycine cleavage system, and serine hydroxymethyl transferase) previously described involved in the photorespiratory pathway in higher plant were identified and represent about 37 % of total soluble proteins. Interestingly, the prominence of ALDH (7.5 %) in leaves suggests a detoxification function of aldehydes. The soluble mitochondrial proteome was also studied in a developmental perspective in order to analyse the effects of the tissue differentiation on the mitochondrial proteome from etiolated leaves, roots and seeds. The comparative study has led to analysis of 45 others spots and to identification of proteins which were specifically present in root (several multiforms of FDH) or in seed (LEA, HSP 22) mitochondrias.
In the second part, we have undertaken a biochemical study of fatty acids and lipoic acid biosynthesis in plant mitochondria. We characterized the enzymes implicated in the step of malonate activation into malonyl-ACP and acetyl-ACP, essential precursors for initiation of fatty acids elongation. This activation is initiated by at least two metabolic pathways: one catalysed by malonyl-ACP synthetase (MAS) and the second by malonyl-CoA synthetase (MCS) coupled to malonyl-CoA: ACP transferase (MCAT). By a method based on a complementary use of mass spectrometry (MALDI-TOF) and radioactivity assay, we characterized and purified the malonyl-ACP synthetase (MAS) and the malonyl-CoA: ACP transferase (MCAT). In pea, we demonstrated two MCAT activities: one located in plastid and the other in mitochondria. As there is only one putative gene coding for the MCAT in Arabidopsis, we started GFP (green fluorescent protein) experiments in order to specify the relation between subcellular localisation and existence of at least two isoformes produced by one gene.