Direction des sciences du vivant

La protéine H du complexe mitochondrial de la glycine décarboxylase (GDC) est une protéine à lipoate qui joue un rôle central dans la décarboxylation oxydative de la glycine. Au cours du mécanisme réactionnel de la GDC, elle interagit successivement avec les trois autres protéines du complexe P, T et L par l’intermédiaire de son bras lipoate fixé de façon covalente à un résidu lysine spécifique. Lors de la décarboxylation de la glycine par la protéine P, le groupement méthylamine qui en résulte est fixé sur le lipoate qui se replie alors dans une cavité hydrophobe au sein de la protéine H. Par mutagénèse dirigée des résidus E14, I27 et S12 de la cavité, nous avons réalisé l’étude des interactions susceptibles de stabiliser le groupement méthylamine dans la cavité. Les protéines H mutantes et la protéine H sauvage ont été analysées par différentes techniques biophysiques puis caractérisées biochimiquement dans la GDC en étudiant la réaction globale et les réactions partielles. Les analyses structurales ont montré qu’une simple mutation pouvait amener à une déstructuration de la protéine H. L’étude fonctionnelle de la protéine mutante structurée HE14A a mis en évidence le rôle crucial des interactions du résidu E14 avec le groupement NH3⁺ de la méthylamine et le carboxyle du résidu S12 dans la stabilisation de la forme chargée en méthylamine. Par ailleurs, les analogies structurales et fonctionnelles des protéines à lipoate et des protéines à biotine nous ont amené à construire un double mutant dans lequel le motif de lipoylation VKA a été remplacé par le motif de biotinylation MKM. Nous avons ainsi montré que les résidus encadrant la lysine, site de fixation du lipoate, n’intervenaient pas dans le mécanisme de lipoylation mais étaient essentiels dans les interactions entre les protéines P et H.
Dans une deuxième partie, nous avons mis en évidence la synthèse du lipoate dans la mitochondrie végétale. La voie empruntée serait analogue à celle du système FAS II des bactéries et des chloroplates conduisant aux acyls-ACP de 4 à 18 carbones, les acyls-ACP à 8, 16 et 18 carbones étant majoritaires. Le malonate est, contrairement à l'acétate, le précurseur de la synthèse du lipoate et des acides gras à longue chaîne synthétisés dans la matrice mitochondriale. Une dizaine d'enzymes indépendantes interviendraient afin d’assurer l’élongation des acyls-ACP. Nous avons commencé la caractérisation biochimique des enzymes initiant la voie de biosynthèse et utilisant le malonate. Les paramètres cinétiques de la malonyl-CoA synthétase (MCS), qui permet d’activer le malonate en malonyl-CoA, ont été déterminés. Deux autres activités enzymatiques ont été mises en évidence, la malonyl-CoA:ACP transacylase (MC:AT), qui convertit rapidement le malonyl-CoA en malonyl-ACP, et la malonyl-ACP synthétase (MAS), qui permet la synthèse de malonyl-ACP directement à partir de malonate. L’élongation de l’unité malonyl-ACP ainsi formée est assurée par des enzymes de condensation conduisant à deux acyls-ACP principaux, l’octanoyl-ACP et l’hexadécanoyl-ACP. Le premier doit être destiné à la synthèse de lipoate grâce à l’insertion de deux atomes de soufre par un donneur inconnu et le second conduirait aux acides gras membranaires à longue chaîne. Nous avons montré que l’apoprotéine H pouvait être octanoylée et lipoylée par un extrait matriciel à partir de malonate. Ainsi, la matrice possède tout l’équipement enzymatique nécessaire à la modification posttraductionnelle de l’apoprotéine H, de la synthèse du groupement lipoate à partir de malonate jusqu’à sa fixation par une enzyme lipoyl ligase.

H protein, a lipoate-containing protein of the mitochondrial glycine decarboxylase complex (GDC), plays a central role in the oxidative decarboxylation and deamination of glycine. It interacts sequentially with the three others components of the complex, P, T and L proteins, through its lipoamide arm covalently bound to a specific lysine residue (K63 in Pisum sativum). When glycine is decarboxylated by P protein, a pyridoxal-phosphate containing protein, the remaining methylamine group is bound to the lipoic acid, which moves in a hydrophobic cleft at the surface of H protein. Using site-directed mutagenesis of E14, S12 and I27 residues from the cavity, we investigated structural interactions that were likely to stabilize the methylamine-lipoyl arm within the hydrophobic cleft. The recombinant mutant and wild-type H-apoproteins were analyzed by several biophysical techniques and then biochemically characterized in the context of GDC reaction, by studying the reconstituted complex and partial reactions. Structural analysis demonstrated that a single mutation could upset the structure of the proteins, resulting in predominantly unfolded proteins. Functional study of the correctly folded mutant H-apoprotein demonstrated that the crucial role of interactions of E14 with the NH3⁺ group of methylamine and carboxyle group of S12 in the stabilization of the methylamine loaded H-protein, a transient species in GDC reactions. Besides, the structural and functional similarity between lipoate proteins and biotin-dependent proteins prompted us to construct a double mutant in which the VKA motif of the lipoyl domain was replaced by the MKM motif of the biotinyl domain. We showed that V62 and A64 surrounding the lipoyl-lysine play an important role in the molecular events that govern the reaction between P and H protein, but do not intervene in the lipoylation mechanism.
In a second part, we demonstrated lipoic acid biosynthesis in plant mitochondria. The pathway could be analogous to FAS II system from bacteria and chloroplasts, leading to C4 to C18 acyls-ACP. Malonic acid is, specifically to mitochondria, the precursor of lipoic acid and long chain fatty acids synthesis. About ten of independant enzymes could intervene to elongate acyls-ACP. We started biochemical characterization of the enzymes which initiate the pathway and manipulate malonic acid. Kinetic parameters of malonyl-CoA synthetase (MCS) which activate malonic acid in malonyl-CoA were determinated. Two more enzymatic activities were characterized, the malonyl-CoA:ACP transacylase (MC:AT), which rapidly catalyze the conversion of malonyl-CoA in malonyl-ACP, and the malonyl-ACP synthetase (MAS) which allows malonyl-ACP synthesis directly from malonic acid. Elongation of malonyl-ACP unit such synthetized is assured by condensing enzymes and leads to two main acyls-ACP products: octanoyl-ACP and hexadecanoyl-ACP. The first one allows lipoic acid biosynthesis thanks to sulfur insertion by an unknown donor and the second one leads to long chain fatty acids. We showed that H-apoprotein could be octanoylated or lipoylated by matrix extract from malonic acid. Thus, matrix ows all the enzymatic equipment to assure the posttranslationnal modification of H-apoprotein, from lipoic acid biosynthesis from malonic acid to its binding by a lipoyl ligase enzyme.